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    酵母蛋白表达系统


    酵母蛋白表达系统

    酵母表达系统是蛋白质真核表达的常用系统之一,具有真核表达系统的许多优点,如蛋白质加工和折叠、翻译后修饰等。酵母蛋白表达的操作与哺乳动物相比相对简单。 巴斯德毕赤酵母的表达水平高于酿酒酵母,细胞可以高密度培养。巴斯德是近年来发展起来的一种较为完善的表达体系,通常用来表达外源蛋白的甲醇营养型酵母表达系统。 (以下提及的酵母蛋白表达为巴斯德毕赤酵母表达)

     

    酵母蛋白表达和大肠杆菌表达之间的差异

    酵母蛋白表达不同于大肠杆菌表达。大肠杆菌表达只需将质粒/载体转入宿主菌中,其载体携带的复制原点随宿主染色体复制而复制,因此可以稳定存在。但酵母表达相对复杂,设计的质粒/载体不具备酵母自身复制原点,如果直接导入宿主菌,无法稳定存在。所以质粒/载体必须线性化,通过同源重组与宿主菌的染色体整合,这样外源基因才能稳定存在,并且同源重组一旦形成就会非常稳定。后期筛选出未整合成功的质粒/载体和宿主菌进行排除,选择整合成功并能高效表达的重组转化子,在一定程度上类似于哺乳动物稳定细胞系的构建原理。

     

    毕赤酵母蛋白表达信息系统主要构成

    1、酵母表达宿主菌

    Mut+和Muts

    在毕赤酵母表达系统中,乙醇氧化酶拥有两个基因编码,即AOX1和AOX2。 细胞内乙醇氧化酶的活性大部分由AOX1提供,菌株对甲醇的利用速度主要由AOX1基因表达的AOX1蛋白提供。 当AOX1不存在而只有AOX2存在时,大部分的乙醇氧化酶活性丧失,细胞利用甲醇的能力低,并且在甲醇培养基上缓慢生长的菌株的表型为Muts。 在AOX1存在下,细胞可以利用甲醇正常生长,在甲醇培养基上生长较快,且该菌株表型为Mut+,这是甲醇营养型毕赤酵母表达两种Muts和Mut+产生的原理。

     

    酵母菌表达系统通常宿主细菌使用

    GS115、 KM71和 SMD1168是常见的表达宿主菌,均为甲醇诱导型。他们都为组氨酸缺陷型。如果表达载体中含有组氨酸基因,可以弥补宿主菌组氨酸缺陷,因此可以在无组氨酸的培养基上筛选重组转化子。在以葡萄糖或甘油等为碳源的培养基上进行生长时,AOX1基因的表达受到抑制,而以甲醇为唯一碳源时,宿主菌的AOX1基因的表达受到强烈诱导,可以使目的基因大量表达。

     

    甲醇诱导是否存在的Mut+和Muts表型。

    毕赤酵母的最适生长过程中温度为28-30℃,诱导期间若超过32℃,不利于相关蛋白进行表达,并且可能导致这些细胞通过死亡。Muts和Mut+菌株在没有甲醇存在的情况下它们的生长发展速率一样,存在甲醇的情况下,AOX1启动子被强烈诱导,Mut+较Muts生长速度更快(4-5倍)。

     

    2、酵母蛋白表达载体

    酵母菌蛋白表达载体的选择

    酵母表达产物有胞内表达和分泌到细胞外表达两种途径,这取决于表达载体的选择和构建是否带有信号肽,可根据基因表达的位点和目的选择合适的酵母蛋白表达载体。

     

    ① 细胞内表达载体:pPIC3、pPICZ、pPSC3K、pHIL-D2等。这些载体在细胞内表达目的基因,可以避免酵母糖基化,适用于通常在胞浆中表达或不含-S-S的非糖基化蛋白,相较于胞外分泌表达水平高但纯化相对复杂。

    ② 分泌到胞外表达的载体: pPic9、 pHIL-S1、 pYAM75p 等。酵母本身分泌少量的外源蛋白,同时将外源蛋白分泌到胞外,有利于目的蛋白的纯化和积累。常用的分泌信号序列是由89个氨基酸组成的α交配因子引导的。

    ③多拷贝插入表达载体:pPIC9K和pPIC3.5K在某些情况下,多拷贝重组基因的整合可以增加蛋白的表达量。

     

    表达重组蛋白使其具体天然的N端

    若要将重组蛋白表达并且使其具体的天然N端,我们可以将目的基因直接连接在Kex2蛋白酶切位点后。Kex2蛋白酶切位点位于信号肽序列中的谷氨酸和精氨酸连接处:Glu-Lys-Arg*Glu-Ala-Glu-Ala *位置是Kex2蛋白酶的酶切位点。

     

    毕赤酵母表达系统的机制/原理

    毕赤酵母之所以能高效表达外源基因,是因为它具有强启动子AOX1和AOX2即乙醇氧化酶启动子。AOX1、AOX2及其产生的Muts和Mut+表现型已在前面描述过。甲醇可以诱导AOX1,葡萄糖或甘油可以抑制AOX1。毕赤酵母表达的外源基因位于酵母染色体上。通过线性化构建的质粒/载体(主要通过酶切),通过同源重组整合到启动子AOX的下游,一般插入到5'AOX启动子和转录终止子信号之间的单克隆位点。

     

    毕赤酵母进行同源重组的方式

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                        质粒/载体和酵母菌表达基因图谱

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    图1:载体图谱:5'   AOX1启动子位点,转录终止子TT,3'   AOX 1位点

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                                                                                                  图2:酵母宿主菌基因

     

    质粒上的PAOX位点(PAOX启动子)或PAOX转录终止子TT或下游3'   AOX1位点与酵母宿主菌基因发生同源重组。

    在酵母宿主菌基因组的下游或者上游其中插入一个或多个质粒载体基因。若插入的质粒载体不破坏酵母宿主菌基因自身的AOX1时,重组转化子的表现型不变为Mut+,反之为Muts。

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                  图3:插入3'   AOX1的重组质粒

     

    质粒/载体基因替代酵母中的 AOX1位点:

    酵母宿主菌的AOX1启动子位点被质粒/载体基因全部替代时,原有的酵母AOX1启动子被破坏,表现型为Muts,取代其的是质粒/载体基因组上的PAOX,目的基因和HIS4表达序列。取代事件发生的不如基因插入事件发生的多。

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                          图4:AOX1位点已被替换

     

    多拷贝插入:

    简单地说就是多次插入质粒/载体基因(进入酵母宿主菌基因组中),自发的概率非常低。

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    酵母表达转化方法比较

    存在几种用于培养的质量较优的酵母宿主细菌和构建好的质粒的同源重组的转化方法,其基于质粒/载体的线性化之后,线性化是转化的开始,用限制性酶进行酶切。

    转化方法

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    毕赤酵母表达系统主要优点    

    1、具体醇氧化酶(AOX)基因的启动子,可严格调控,实现高水平表达

    2、强烈的好养生长偏爱性,可进行细胞高密度培养,发酵罐可达120g/L

    3、具有真核细胞翻译后修饰的功能,蛋白更具生物活性

    4、高水平分泌表达外源蛋白,有利于纯化

    5、可实现胞内表达和胞外分泌表达两种形式

     

    酵母蛋白表达影响因素

    启动子的选择

    醇氧化酶基因启动子PAOX是酵母表达系统中常用的启动子,具有较强的诱导性和强启动性。PGAP启动子是从毕赤酵母中克隆出来的组成型启动子。在PGAP控制下,LabZ基因的表达高于甲醇诱导下的PAOX基因的表达,并且LabZ不需要甲醇诱导,这使得放大工艺更加方便。

    目的基因的优化

    目的基因是决定表达成败的主要因素。 由于密码子的简并性,不同的表达系统有各自的特定偏好密码子。 因此,在基因合成过程中,应优化密码子,取代稀有密码子,优化mRNA结构,提高蛋白表达量,防止蛋白不表达或低表达。

    影响蛋白分泌的因素

    如果一个蛋白本身具有不易分泌的特点,即不适分泌表达,可尝试在用酿酒酵母的α-AMF(交配因子)信号肽序列,对胰岛素、凝血因子等小分子提供有用,在α-AMF和目的就是基因技术之间插入间隔肽能够有效提高目的蛋白的表达水平。信号肽会影响作用蛋白分泌表达的水平。此外,其他影响因素还包括重组转化子的筛选,遗传背景的影响,蛋白的稳定性影响等等。

     

     


     


     


     


     

     

     

     

     

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