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瑞源医学
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- 产品描述
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服务简介
双荧光素酶报告基因系统通过共表达萤火虫荧光素酶（受待研究调控元件驱动）和海肾荧光素酶（内参），先后加入底物荧光素和腔肠素，利用化学发光仪检测荧光比值，以校正转染效率等误差，主要用于启动子活性、转录因子及miRNA靶标验证等研究。
服务优势
1、灵敏度高：荧光素酶催化产生的生物荧光信号强、背景低，可检测微弱的转录调控变化。
2、双报告基因归一化：内参（海肾）校正转染效率、细胞活力、裂解效率等实验误差，数据更可靠。
3、操作简便、快速：无需放射性同位素，加样后即时读值，适于高通量筛选。
4、样本适用性广：覆盖多种哺乳动物细胞及组织样本。
应用场景
1. 验证miRNA与靶基因的作用。
miRNA可以通过基因剪切或翻译抑制等方式来调控靶基因，精准控制其表达水平。通过将待测靶基因序列（3’UTR）插入LUC的报告基因载体，当miRNA能够和靶基因作用时，miRNA会通过和所插入的序列结合从而抑制荧光素酶的翻译使荧光值降低。
2. 转录因子对下游基因的作用。
转录因子与其靶启动子中的特异序列（顺式作用元件）结合，从而对基因的表达进行调控。通过将启动子区域序列插入LUC的报告基因载体，同时共转入转录因子，当转录因子能与对应启动子结合，则可以转录翻译产生荧光素酶提升荧光值。
收样标准
类型 送样标准 运输条件 细胞 T25瓶（活率>95%）或冻存细胞（>1×106 cells），提供细胞名称和培养方式 1、T25瓶细胞使用常温或冰袋运输，不可使用干冰，T25瓶封口膜密封，填充新鲜培养基充满容器 > 90%体积，固定后选择最快运输方式进行寄送。若冰袋运输，注意细胞面远离冰袋。
2、对于长距离或无法保证快速运输的情况，强烈建议-80℃冻存细胞后干冰寄送。
菌液 提供抗性，菌液量>0.5 mL，放置一年以上的甘油菌需活化后送样 菌液使用干冰寄送;
干冰使用量：1天（5 kg）、2-3天（10-20 kg）、3-5天（20-30 kg）
质粒 提供抗性，质粒量>20 ug 质粒使用冰袋寄送 平板菌 无污染 常温寄送 注意：干冰取样及运输，至少在送样前2天通知我司。 服务内容
服务内容 自然日 交付材料 1、载体构建-基因合成
转录因子-启动子应用方向
1）转录因子载体pcDNA3.1
2）启动子载体pGL3-Basic Vector
miRNA-靶基因应用方向
1）miRNA合成
2）靶基因载体pmirGLO
15个 1、基因合成/载体构建的质粒及测序验证报告
2、双荧光素酶检测原始数据表格（设置实验组和对照组，做3次重复）
3、标准实验报告(含实验步骤、流程)
2、动物细胞293T细胞转染
3、荧光素酶检测
4、设置对照组、实验组
15个 5、定量分析
6、数据整理
5个 案例报告
1. 转录因子-启动子应用结果分析
结果显示，相较于pGL3-Basic空载对照组，转录因子B可显著上调A-Full野生启动子的转录活性；当A启动子关键结合序列发生突变（A-Mut）后，B介导的转录激活效应显著下降。证实转录因子B通过靶向结合A基因启动子的该关键序列，正向调控A基因转录。
2. miRNA-靶基因应用结果分析
根据双荧光报告实验的结果，在加入miRNA3/4后，与miRNA3相比，miRNA4会显著降低G18的萤火虫荧光强度及相对荧光强度；miRNA3/4对M6-2的萤火虫荧光强度及相对荧光强度没有显著变化。
常见Q&A
Q：如何选择萤火虫和海肾报告基因的启动子？
A：萤火虫报告基因使用待研究的调控元件（如目标启动子、3‘UTR）；海肾内参使用强组成型启动子（如CMV、SV40、TK），确保其表达不受实验处理影响。
Q：两种质粒的转染比例应为多少？
A：通常萤火虫：海肾质量比为10:1 ~ 50:1（海肾用量少），避免内参信号过强掩盖实验组变化；需通过预实验确定最佳比例。
Q：miRNA过表达后荧光下降不明显（<30%），能算阳性吗？
A：一般要求抑制率 > 40% ~ 50% 且有统计学差异（p < 0.05）。弱抑制需同时突变结合位点并恢复表达，或通过其他方法（如qPCR验证内源靶基因）交叉验证。
Q：如何计算最终结果？
A：相对荧光素酶活性 =萤火虫荧光值 / 海肾荧光值。每组设置3个以上复孔，取比值后计算均值±SD，再以对照组为基准归一化（如设对照组为1）。
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