科研服务
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- 产品描述
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服务简介
酵母文库构建是一项将外源DNA片段（如cDNA、基因组DNA或人工设计的序列）高效插入酵母表达载体，并转化进酵母细胞群体，形成大规模克隆集合的核心技术。该文库可用于高通量筛选目标基因或研究基因功能。瑞源生物可提供以下三种建库方法：In-Gate技术、SMART技术、Gateway技术。
技术原理
In-Gate技术：
核心机制：同源重组（HR）技术。
构建含同源重组接头的线性化载体；将目的基因两端添加同源重组接头，通过一步同源重组直接连接，形成完整文库质粒
SMART技术：
核心机制：基于反转录酶的模板切换功能。
在RNA逆转录时，通过SMART引物在cDNA的5'端添加特定序列；利用LD-PCR（长距离PCR）扩增cDNA，并与线性化载体通过体内重组连接。
Gateway技术：
核心机制：依赖λ噬菌体重组酶系统（BP/LR反应）。
BP反应：将目的基因克隆到入门载体；
LR反应：通过重组酶将基因转移到目标表达载体。
酵母文库构建技术对比
In-Gate技术
SMART技术
Gateway技术
步骤
1步同源重组
逆转录+PCR+重组
2步重组（BP+LR）
耗时
较短
中等
较长（初始构建慢）
成本
较低
中等
高（试剂昂贵）
RNA需求量
高（>400 μg）
极低（>2 μg）
高（>400 μg）
保真度
高（无PCR步骤）
中（PCR可能突变）
高（无PCR）
优势
一步重组，高效快速，适合高通量筛选
高全长率（减少移码突变）
适用微量RNA样本（如稀有组织）
均一化处理提升低丰度基因检出率
克隆效率高（>95%），阅读框精准保留
可多载体穿梭（同一基因导入不同表达系统）
劣势
新技术，应用案例较少
实验条件依赖性强（如同源接头设计）
PCR扩增可能引入碱基突变或移码
操作复杂（需优化逆转录条件）
两次重组导致低丰度基因丢失
成本高（重组酶试剂昂贵）
服务优势
1、具备多种材料RNA提取方法，高质量RNA有效提高后续文库质量
2、完善的质检流程，文库进行PCR鉴定，确保文库质量
3、提供后续文库售后和下游筛库指导
4、建库一年送三险，运输损坏险、储存不当险、意外丢失险，解决后顾之忧
5、根据不同的载体需求，提供文库个性化定制
交付内容及周期
服务内容
交付周期（工作日）
交付材料
（In-Gate）酵母核/膜文库构建
RNA提取
mRNA提取
5个
酵母核文库甘油菌8 ml（分8管）；酵母膜文库甘油菌4 ml（分4管）
2. 酵母核文库质粒600 μg（分6管）；酵母膜文库质粒（4管 ＞400 ug）
3. Word文档电子版项目报告（含实验数据）
4. 文库承诺达到以下指标：
文库库容量>1*107 CFU
核文库平均插入片段1-1.5 kb (因物种而异)；膜文库平均插入片段0.8 - 1.5 kb(因物种而异)
空载率<5%
cDNA合成
cDNA与接头连接
cDNA分级分离
5个
重组到酵母载体pGADT7(核)/pPR3-N(膜）上和电转化
将获得的cDNA文库电转化至大肠杆菌感受态细胞中进行克隆扩增
5个
文库检测和质粒提取
5个
数据整理和分析
2个
转录组测序、文库全测序、GO+KEGG分析
15个
（SMART）酵母核/膜/逆境文库构建
RNA提取
mRNA提取
5个
酵母文库甘油菌各4 ml(分4管）
酵母文库质粒（4管＞400ug）
Word文档电子版项目报告(含实验数据)
文库承诺达到以下指标:
文库库容量>1*107 CFU
平均插入片段0.8 -1.5 kb（因物种而异）
空载率<5%
cDNA合成与接头连接（三框文库）
cDNA均一化
重组到酵母载体pGADT7(核)/pPR3-N(膜）/pYES2 - NTB(逆境)上和电转化
将获得的cDNA文库电转化至大肠杆菌感受态细胞中进行克隆扩增
文库检测和质粒提取
数据整理和分析
17个
转录组测序、文库全测序、GO+KEGG分析
15个
（Gateway）酵母核/膜文库构建
RNA提取
mRNA提取
5个
初级文库、次级文库甘油菌各4 ml(分4管）
初级文库（2管＞200ug）、次级-核文库质粒（4管＞400ug）、次级-膜文库质粒（4管＞400ug）
Word文档电子版项目报告(含实验数据)
文库承诺达到以下指标:
文库库容量>1*107 CFU
平均插入片段0.8-1.5 kb（因物种而异）
空载率<5%
cDNA第一链合成
cDNA第二链合成
cDNA adapter的制备
cDNA与attB1重组接头连接
cDNA分级分离
BP重组(pDONR222)
电转化大肠杆菌DH10B
文库质检与质粒提取
文库质粒重组pGADT7(核)/pPR3-N(膜）电转化大肠杆菌DH10B
文库质检与质粒提取
数据整理和分析
17个
注：酵母核、膜、逆境文库构建所用载体不一样。
案例展示
收样标准
SMART建库
Gateway、In-Gate建库
取样注意事项
RNA样品
>2ug
>400ug
需要质量较好无降解的RNA。需要提供琼脂糖电泳检测胶图，能清晰的看到28S和18S两条带
植物组织（根茎叶种子）
单个样品重量>2g，需要至少一份备份样品
单个样品重量>10g，需要至少一份备份样品
（叶片/花/茎/种子）剪取适量新鲜新鲜样品；（根系）将根部泥土清洗干净后再将根系剪下来，用锡箔纸包好或者放入50mL离心管中，写上编号，置于液氮速冻
植物组织（果实）
单个样品重量>10g，需要至少一份备份样品
单个样品重量>50g，需要至少一份备份样品
果实样品较大，如桃肉等，利用工具将果肉切成1-2cm块状大小，用锡箔纸包好或者放入50mL离心管中，写上编号，置于液氮速冻
动物组织/昆虫
单个样品重量>2g，需要至少一份备份样品
单个样品重量>10g，需要至少一份备份样品
取适量的组织、昆虫样品，放入50mL离心管中，写上编号，置于液氮速冻
真菌
单个样品重量>2g，需要至少一份备份样品
单个样品重量>10g，需要至少一份备份样品
真菌为液培状态，离心收集去除上清，放入50mL离心管中，写上编号，置于液氮速冻，真菌为平板菌状态，需要使用封口膜封好，泡沫固定在泡沫盒内，常温或冰袋寄送。
动物细胞/PBMC
单个样品细胞>1*107 cfu，需要至少一份备份样品
单个样品细胞>1*108 cfu，需要至少一份备份样品
细胞：用PBS将细胞洗下来，600g转速离心，弃上清，收集细胞，将整个EP管置于液氮速冻。PBMC：尽量使用采集后24h内的血液进行PBMC分离；体积为500-1000ul，使用无菌管保存，如果有抗凝剂最好加入抗凝剂，放-80℃保存。
取样方法及注意事项
快速收集：样本需要在采集、制备、储存、运输中尽量做到迅速和及时性，尽可能缩短样本采集到实验的周期，从而保证样本的质量和稳定性。
低温保存（鲜样样本）：采集样本离体后，如有分离步骤需要在4℃条件或冰上等低温环境下进行，分离好的样本立即置于液氮、干冰或-80℃冰箱中，并保证在实验前处于-80℃以下。
样品包装：建议样品用锡箔纸、离心管包装，使用油性记号笔填写样本编号，再装入自封袋中，避免样品包装破损样品散落。
样品寄送：样品名称简单、清晰、准确，填写好样品委托单后打印纸质版随样品一起邮寄；选择合适大小的泡沫盒，干冰用量1天（5kg），2-3天（10-20kg）3-5天（20-30kg），并密封。
声明：本公司出售产品只能用于科研目的，不得用于诊断或者治疗！
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