科研服务
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- 产品描述
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服务简介
南京瑞源生物采用先进的Illumina测序平台，快速、高效地读取高质量的测序数据，以精准快捷为核心，准确检测样品间的重要变异信息，对候选基因进行注释后能通过荧光定量PCR、EMSA、酵母单杂、酵母双杂等实验进行候选基因验证。仅需客户提供原始材料，南京瑞源生物进行建库测序、BSA分析、基因挖掘、功能验证一条龙服务，节约客户等待时间。
技术原理
BSA(Bulked segregation analysis)即混合分组分析(BSA，or 集群分离分析法)，也称分离群体分组分析。是指利用目标性状存在极端表型差异的两个亲本构建分离群体，在子代分离群体中，选取两组表型差异极端的个体分别构建混合池，结合高通量测序技术对混合样本测序，比较两组群体在多态位(SNP)的等位基因频率(AF)是否具有显著差异，定位与目标性状相关联的位点并对其进行注释，研究控制目标性状的基因及其分子机制。
应用领域
瑞源生物重测序BSA分析主要应用于定位植物、动物中控制重要性状的基因，如产量、抗病性、耐逆性等相关基因，用于辅助育种；
1、基因定位：识别与特定表型相关的基因或基因组区域；
2、候选基因挖掘：发现可能导致表型变异的候选基因；
3、分子标记开发：开发与目标性状关联的分子标记，用于辅助选择或育种；
4、基因功能研究：通过关联分析结果，预测基因功能并设计后续实验进行验证。
技术优势
1、创新技术：采用先进的Illumina测序平台，快速、高效地读取高质量的测序数据；主要使用BWA[1]软件进行短序列与参考基因组比对，GATK[2]软件实现变异检测，用SnpEff[3]软件进行变异注释
2、效率提升：采用ΔSNP Index及ED两种方法定位SNP
3、候选基因功能验证：南京瑞源生物具有多年的候选基因功能验证经验，通过荧光定量PCR、EMSA、酵母单杂、酵母双杂等实验，批量化的流水线作业减少个体实验的误操作差异概率；
4、节约客户时间：仅需客户提供原始材料，南京瑞源生物进行建库测序、BSA分析、基因挖掘、功能验证一条龙服务。
服务流程
收样指南
样本类型 送样量 备注 基因组DNA > 0.5 μg 浓度>20 ng/uL，体积>15 μL，主条带完整，
OD260/280在1.7-1.9之间，-20℃保存，干冰运输
植物组织 鲜重>0.5g 液氮速冻，-80℃保存，干冰运输 动物组织 鲜重>0.2g 新鲜组织，液氮速冻，-80℃保存。干冰运输 细胞 细胞量>1x106 细胞沉淀，液氮速冻，-80℃保存，干冰运输 血液(抗凝) 全血>1ml 液氮速冻，-80℃保存，干冰运输 亲本选择表型差异极端的两个，子代选择极端表型个体各20各。建议每个子代样本单独提取 DNA 后再等量混合，可以减少背景噪音，避免系统误差；需要选择有参考基因组的物种。
服务内容
服务说明
1、BSA性状定位适用于对家系群体的单个性状进行主效定位；建议尽可能选择性状差异单⼀，杂合位点少的亲本。对于⽬标性状亲本，有多种⽅法获得，例如 EMS 诱变，⾃然个体，紫外线诱变等。
2、如果研究的性状是EMS诱导的突变性状，可以只测两个⼦代池（野⽣型＋突变型），或者测 1个亲本（野⽣型）和1个⼦代池（突变型）；如果研究的性状是数量性状，建议测2个亲本和2个⼦代池；
3、建议每个子代样本单独提取 DNA 后再等量混合，可以减少背景噪音，避免系统误差。
4、对于无参考基因组的物种、高度杂合的群体，目前无法进行BSA分析
案例展示
BSA分析：
候选基因验证：
BSA分析中，除了获得候选区域，候选基因的功能验证也十分重要，需要利用实验证明候选基因与性状表型间的联系。可根据客户产品需求，南京瑞源生物提供以下候选基因验证服务：
1、荧光定量PCR
2、EMSA
3、酵母单杂互作验证
4、酵母双杂互作验证
实验材料
1、测序平台：Illumina高通量测序平台。
2、实验方案设计：从材料选取，建库测序，到数据分析，每一步都会进行科学、缜密的设计，以保障高质量研究成果。
3、支持的分析方法：ED算法和SNP-index算法。ED法具有很强的去除背景噪音能力，一大优势就是无需亲本的信息即可进行定位；SNP-index方法通常需要亲本的测序信息，可排除两个亲本相对于参考基因组共有的SNP，去除背景噪音，也可去除一部分SNP index趋近于1但是与目标性状并非连锁的标记。
4、支持的候选基因验证方法：荧光定量PCR、EMSA、酵母单杂、酵母双杂等实验，具体实验根据客户需求进行安排。
参考文献
[1] Li H, Durbin R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 2009 Jul 15;25(14):1754-60. doi: 10.1093/bioinformatics/btp324. Epub 2009 May 18. PMID: 19451168; PMCID: PMC2705234.
[2] McKenna A, Hanna M, Banks E, Sivachenko A, Cibulskis K, Kernytsky A, Garimella K, Altshuler D, Gabriel S, Daly M, DePristo MA. The Genome Analysis Toolkit: a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data. Genome Res. 2010 Sep;20(9):1297-303. doi: 10.1101/gr.107524.110. Epub 2010 Jul 19. PMID: 20644199; PMCID: PMC2928508.
[3] Cingolani P, Platts A, Wang le L, Coon M, Nguyen T, Wang L, Land SJ, Lu X, Ruden DM. A program for annotating and predicting the effects of single nucleotide polymorphisms, SnpEff: SNPs in the genome of Drosophila melanogaster strain w1118; iso-2; iso-3. Fly (Austin). 2012 Apr-Jun;6(2):80-92. doi: 10.4161/fly.19695. PMID: 22728672; PMCID: PMC3679285.
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