酵母膜系统双杂交文库筛选及验证

泛素作为降解信号分子，可以连接另外一种蛋白质的N端，然后被泛素专一性蛋白酶（UBPs）识别，从而导致与泛素相连的蛋白被酶解。在膜双杂体系中泛素被分为两部分：N端（Nub），C端（Cub）。泛素Nub的3位异亮氨酸突变为甘氨酸（NubI突变为NubG）。

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产品描述

服务描述

泛素作为降解信号分子，可以连接另外一种蛋白质的N端，然后被泛素专一性蛋白酶（UBPs）识别，从而导致与泛素相连的蛋白被酶解。在膜双杂体系中泛素被分为两部分：N端（Nub），C端（Cub）。泛素Nub的3位异亮氨酸突变为甘氨酸（NubI突变为NubG）。与Cub的亲合力大大降低。Cub部分与人工合成的LexAVP16转录激活因子融合成一个融合蛋白Cub-LexA-VP16。由于亲和力下降，正常条件下NubG不与Cub结合，UBPs也不能识别分离的泛素，转录激活因子也不会被切下来。将要检测的蛋白质分别与NubG和Cub融合，形成bait融合蛋（baitcub-LexA-VP16）和prey融合蛋白（prey-NubG）。如果bait和prey发生相互作用，就会促使NubG和Cub的相互接近，被UBPs识别，导致LexA-VP16被剪切，进入核内，从而激活报告基因的转录。

系统	载体		转化标记	菌株	报告基因
DUAL membrane	诱饵载体	pBT3-SUC	LEU2	NMY51	HIS3; ADE2; LacZ
		pBT3-STE	LEU2
		pBT3-N	LEU2
	猎物载体	pPR3-N	TRP1

N 端位置	C端位置	诱饵载体	备注
胞质	胞外/细胞器腔	pBT3-N	—
胞质	胞质	pBT3-N/PBT3-STE	—
胞外/细胞器腔	胞质	pBT3-SUC	N 端有信号肽
胞外/细胞器腔	胞质	pBT3-STE	N 端无信号肽

注：若N端和C端都位于胞外，可截短使得C端出现位于胞内段，再选择相应载体

技术原理

自激活检测及功能验证

实验设置自激活检测，进行3-AT浓度筛选，确定最佳3-AT筛选浓度后进行后续实验

实验设置功能重复对照，AD载体为pOst1-NubI。如果诱饵蛋白在酵母细胞中正确表达，并定位到酵母细胞膜上，同时与诱饵蛋白融合的Cub-LexA-VP16结构定位于细胞质侧，则其将与Ost1-NubI结构域互作，从而形成完整的泛素，激活报告基因表达。

诱饵质粒	猎物质粒	备注
pBT3-SUC/STE/N-A	pPR3-N-B	实验组
pBT3-SUC/STE/N	pPR3-N-B	对照组
pBT3-SUC/STE/N-A	pPR3-N	对照组
pBT3-SUC/STE/N-OsPT2	pPR3-N-OsPP95	阳性对照组
pBT3-SUC/STE/N-A	pOst1-NubI	功能验证组

技术优势

1、进行文库鉴定，选择高质量文库进行筛库，确保筛库结果可靠
2、质粒转化酵母后 pcr鉴定，确保质粒成功转化酵母
3、诱饵设置梯度浓度筛选，确保合适的筛选条件
4、涂板 20 个，提供阳性克隆、诱饵酵母菌液交付
5、提供 NGS 测序，检测全部阳性克隆
6、根据物种数据库信息，进行生信分析，挑选基因
7、可提供完善的下游验证实验

样品接受标准

1、酵母文库筛选（双/单杂）技术服务

类型		送样标准	运输条件
诱饵	诱饵基因序列	无	无
	构建好的诱饵质粒	质粒浓度≥100ng/ul，质粒体积≥30ul；有完整的测序文件；	冰袋
	含构建好诱饵质粒的菌液	每管体积≥500ul；有鉴定测序文件；	干冰，1天（5kg）2-3天（10-20kg）3-5天（20-30kg）
文库	构建好的文库质粒	质粒浓度≥200ng/ul，质粒总量≥50ug；有鉴定测序文件；	冰袋
文库	文库质粒菌液	每管体积≥1mL，提供至少2管；有鉴定测序文件；	干冰，1天（5kg）2-3天（10-20kg）3-5天（20-30kg）

2、酵母一对一验证技术服务

类型	送样标准	运输条件
诱饵/猎物基因序列	无	无
构建好的诱饵/猎物质粒	质粒浓度≥100ng/ul，质粒体积≥30ul；有完整的测序文件；	冰袋
含构建好诱饵/猎物质粒的菌液	每管体积≥500ul；有鉴定测序文件；	干冰，1天（5kg）2-3天（10-20kg）3-5天（20-30kg）

服务内容

常见问题及解答

1、膜体系筛库前为什么要做功能验证？

因为膜体系筛库，一般是针对诱饵为膜蛋白的酵母杂交实验，而由于膜蛋白的肽链跨膜方向不同，为确认构建的Bait-Cub诱饵载体在酵母细胞中是否形成正确定位和功能的融合蛋白，膜体系筛库前，需对诱饵蛋白在酵母细胞中是否正确表达进行检测，即功能验证（functional assay），实验中用到的对照AD载体为pOst1-NubI。NubI不依赖猎物蛋白能单独与Cub结合，从而激活报告基因，从而证明诱饵蛋白适用于膜体系实验。

2、酵母双杂实验中，用膜文库筛选出来的一定是膜蛋白吗？

并不一定，膜体系使用的文库与核体系的区别就在于他们使用的载体不同，但是其中包含的cDNA其实是同种类型的，也就是说，经过筛库，我们筛到的可能是膜蛋白、核蛋白、细胞器蛋白等一系列蛋白。

案例报告

膜体系文库筛选回转验证结果：