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    科研服务

    立足于生命科学,为基础研究领域科学工作者提供生物学高端技术服务

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    酵母膜系统双杂交文库筛选及验证

    酵母双杂是一种利用酵母表达系统分析蛋白质相互作用的技术,它具有高度敏感性和广泛应用性。

    • 产品描述
    • 酵母双杂是一种利用酵母表达系统分析蛋白质相互作用的技术,它具有高度敏感性和广泛应用性。

       

      技术原理

      1、泛素 (ubiquitin) 可以分成两部分:N 端 (Nub) 和 C 端 (Cub);

      2、Nub 与 Cub 有很强的亲和力,当在同一细胞同时表达时,Nub 与 Cub 会结合形成完整的泛素,会被泛素蛋白酶 (UBPs) 识别并切割 ;

      3、Nub 第三位的异亮氨酸突变成甘氨酸后 (NubI → NubG),Nub 与 Cub 的亲和力大大降低。

      4、Cub 融合转录因子 LexA-VP16,诱饵构建在 Cub 上,猎物构建在 NubG 上 ;

      5、当诱饵与猎物互作,使得 Cub 与 NubG 靠近而形成完整的泛素,UBPs 识别并切割 ;

      6、被切下的转录因子 LexA-VP16 进入核内,启动报告基因 (His,Ade,LacZ) 的表达

      技术优势

      1、在体内原位检测蛋白 - 蛋白间的相互作用而无需核定位信号
      2、使用小的泛素结构域 (NubG/Cub) 使得相互作用蛋白质之间的空间位阻最小化
      3、蛋白间的互作信号靠泛素特异性结合蛋白 (UBPs) 剪切人工转录因子 (LexA) 启动,而不是靠转录,因此可以检测蛋白自身的转录激活或抑制序列
      4、此体系可以用来研究两个膜蛋白的相互作用和一个膜蛋白与一个胞质蛋白的相互作用
      5、任何一种膜蛋白都可以作为诱饵,能使与待检测蛋白融合的相互作用模块 (Cub-PLV-NubG) 定位在细胞质内
      6、交付升级:增加报告基因 (LacZ) 进行更为严格的筛选,每个报告基因的上游调控区域各不相同,从而减少假阳性,提高互作可能性

      升级前 升级后 优势亮点
      QDO(Quadruple dropout media,四缺培养基,SD-Trp-Leu-His-Ade) QDO+X-gal 有些克隆能在 QDO 上生长,但没有 β-Gal 活性,增加报告基因(LacZ)进行更为严格的筛选,
      每个报告基因的上游调控区域各不相同,从而减少假阳性,提高互作可能性

       

      样本要求

      样品类型 样品需求 保存条件(℃) 运输条件
      细胞样本 细胞数量大于 1*107 -80 干冰
      动物样本 大于 1 g -80 干冰
      植物样本 大于 2 g -80 干冰
      总 RNA 大于 200 μg -80 干冰

       

      服务内容

      酵母膜文库筛选
      实验步骤 周期(工作日) 交付材料
      1、跨膜结构分析 0 天 1、阳性克隆测序结果(根据测序结果而定 )
      2、阳性克隆序列大于 8 条 ( 不移码 )
      3、Word 文档电子版项目报告 ( 含实验数据)
      4、诱饵质粒
      5、GO+KEGG 分析结果
      2、基因合成 ( 密码子优化 )/ 载体构建 15 天
      3、诱饵质粒的自激活检测 10 天
      4、诱饵质粒与文库质粒共转
      5、酵母筛选的条件优化
      6、筛选结果测序
      20 天
      7、筛选结果回转验证
      8、数据整理和分析
       5 天
      9、NGS 测序
      10、数据整理分析
      10 天

       

      酵母膜文库一对一验证
      基本实验步骤 详细实验步骤 周期(工作日) 交付材料
      跨膜分析 1、跨膜结构分析 0 天 1、构建的重组质粒
      2、电子版文库实验报告 1 份
      基因合成 2、基因合成 ( 密码子优化 )/ 载体构建
      3、诱饵蛋白 A 载体构建至 pBT3-N/SUC/STE
      4、蛋白 B 载体构建至 pPR3-N
      15 天
      转化 5、重组质粒转化酵母细胞并进行自激活检验 15 天
      互作验证 6、设置阳性对照、阴性对照组,互作验证 10 天

       

    声明:本公司出售产品只能用于科研目的,不得用于诊断或者治疗!

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