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服务描述
遗传报告基因系统目前广泛应用于真核基因表达和细胞生理学研究，单报告基因实验往往会受到各种实验条件的影响，双报告基因常被用来提高实验准确性。
“双报告基因”指在一个系统中同时表达和测量两种单独的报告基因酶，通常，实验报告基因与特定实验条件产生的效应相关，共转染“对照”报告基因则为实验提供基准线，有效减少外在因素对实验结果产生的影响，提高实验数据可信度。
技术原理
该系统包括萤火虫荧光素酶（Firefly luciferase）和海肾荧光素酶（Renilla luciferase）。两者可催化各自的底物发生氧化作用产生生物荧光，产生的荧光数值大小即表示了两种酶的表达量多少。萤火素酶可以与底物萤火素（luciferin）结合催化其氧化产生氧化萤火素（oxyluciferin），萤火素在氧化过程中会发出生物荧光。海肾萤光素酶可以催化底物腔肠素（coelenterazine）氧化生成高能产物coelenteramide发出生物荧光。
把感兴趣的基因转录的调控元件克隆在萤火虫荧光素酶基因的上/下游，构建成荧光素酶报告质粒。然后转染细胞，经适当刺激或处理后裂解细胞，测定荧光素酶活性。通过荧光素酶活性的高低判断刺激前后或不同刺激对感兴趣的调控元件的影响。
同时将海肾荧光素酶基因作为内参使用，将两个报告基因构建到同一个质粒上，分别用不同的启动子启动其表达，消除细胞转染效率和细胞转录活性对实验结果产生的影响。
技术优势
体内实验：内源性表达，更真实的展示体内的互作情况
高灵敏度：不受细胞内其他物质的影响
高准确性：植物、哺乳动物中无报告基因内源性表达
应用场景
1. 验证miRNA与靶基因的作用：
miRNA可以通过基因剪切或翻译抑制等方式来调控靶基因，精准控制其表达水平。通过将待测靶基因序列（3’UTR）插入LUC的报告基因载体，当miRNA能够和靶基因作用时，miRNA会通过和所插入的序列结合从而抑制荧光素酶的翻译使荧光值降低。
2. miRNA和lncRNA/circRNA的靶向互作
许多lncRNA具有与mRNA相似的结构，miRNA可通过与作用于mRNA类似的机制对lncRNA起负调控作用。将候选的lncRNA序列插入报告基因载体上，当miRNA能够和Inc/circRNA作用时，miRNA会通过和所插入的序列结合从而抑制荧光素酶的翻译使荧光值降低。
3. 转录因子对下游基因的作用
转录因子与其靶启动子中的特异序列（顺式作用元件）结合，从而对基因的表达进行调控。通过将启动子区域序列插入LUC的报告基因载体，同时共转入转录因子，当转录因子能与对应启动子结合，则可以转录翻译产生荧光素酶提升荧光值。
4. 启动子结构分析
将启动子区域序列进行分段截短，或对特定位点进行突变，再分别构建入荧光素酶报告载体，检测其启动子活性。
5. 启动子SNP分析：
一些基因的启动子区域存在单核苷酸多态性，可运用萤光素酶报告系统分析其相对活性。
6. 验证启动子活性：
将待测启动子构建至荧光素酶基因的上游，检测启动子的活性。
7. 验证转录因子活性：
将待测转录因子与GAL4结合域构建在同一载体上，与含有GAL-TATA转录调控原件并带有荧光虫荧光素酶(Firefly luciferase)的表达载体共转，使这段序列调控luciferase的转录表达。通过检测荧光值的高低可以判断转录因子是否具有转录激活或者转录抑制作用。
样品要求
类型
送样标准
运输条件
需要基因合成的序列
无
无
构建好的质粒
中间载体质粒
浓度>100ng/ul，体积>20ul；提供载体序列和抗性，无污染。
冰袋
含构建好质粒的菌液
含中间载体质粒的菌液
体积>500ul；提供载体序列和抗性，无污染。
干冰，1天（5kg）2-3天（10-20kg）3-5天（20-30kg）
平板菌
无污染
常温
服务内容
服务流程
工作日
交付材料
客户下单 10个
1、重组质粒一份
2、重组质粒测序结果
3、实验原始图片，每片叶子上做4组，包含实验组1个、对照组3个，设3次生物学重复，交付3片叶子照片
4、（定量）双荧光素酶检测原始数据
5、标准实验报告(含实验步骤、流程)实验材料确认 基因合成/载体构建 烟草注射
荧光素酶检测
设置对照组、实验组
10个
定量分析
数据整理
5个
合计 25个
备注：若不互作，则不进行定量分析，仅收取定量分析前的相关服务费用。
服务流程
工作日
交付材料
客户下单
10个
- 基因合成/载体构建的质粒及测序验证报告
- 原始数据、结果图片
- 标准实验报告(含实验步骤、流程)
实验材料确认
基因合成/载体构建
动物293细胞转化
10个
荧光素酶检测
定量分析
5个
数据整理
合计
25个
案例展示
烟草体系：
为了确定Protein A在体内的DNA结合能力，我们在烟草瞬时转化体系中进行了双荧光素酶测定。结果显示pro-LUC与Protein A的相对LUC/REN活性明显高于启动子与空载体的组合，表明Protein A能与启动子结合。
图1 Protein A与启动子在烟草中的互作情况
双荧光素酶检测实验，烟草叶片中共表达pro-LUC与Protein A、pro-LUC与empty vector。计算相关荧光素酶活性（LUC/REN），使用Student’s t检验确定显著差异，**P＜0.01。
动物293细胞体系
为了确定Protein A在体内的DNA结合能力，我们在动物293细胞体系中进行了双荧光素酶测定。结果显示pro-LUC与Protein A的相对LUC/REN活性明显高于启动子与空载体的组合，表明Protein A能与启动子结合。
常见问题及解答
1. 荧光值过高或过低怎么办
荧光值一般读数在5-6位之间较好，若荧光值过高或过低可尝试从以下方式解决：
（1）荧光值过高：
a、减少质粒转染量；
b、细胞样品裂解后，离心取上清后检测或对裂解产物进行稀释后检测。
（2）荧光值过低：
a、转染效率低：优化转染实验条件，确保转染DNA的质量；
b、样品裂解效率低：细胞培养时间不宜过长，长时间培养后，细胞可能会难裂解；加入的裂解液需足量，裂解时间控制在24-48小时保证细胞能够充分裂解。
c、检测过程操作不规范：应室温条件下反应，即各个组分包括细胞裂解液、底物工作液都需要调整至室温
d、底物氧化失败：底物避光密封保存，萤火虫荧光素酶底物-20℃保存；海肾荧光素酶底物推荐-80℃保存；反应工作液建议现用现配。
2. 复孔重复性差
报告基因检测灵敏度高，影响因素多。除了引入另一个报告基因作为内参照避免实验条件变化的干扰之外，一般还需设置3个或3个以上复孔，应尽可能减小复孔之间的差异性，复孔之间的数值有一定差异是正常的，一般认为在同一个数量级的差异是可以接受的。
a、细胞裂解后建议离心取上清，保证样本的均一性；
b. 保证加样的准确性，移液器需定期校准，确保移液精准；
3. 萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的区别
萤火虫荧光素酶在氧气、ATP和镁离子同时存在的条件下，催化荧光素氧化，生成氧化荧光素，同时产生黄绿色光，波长540-600nm，一般检测时选用560nm。海肾荧光素酶只需要氧气就可以催化腔肠素氧化产生蓝光，波长460-540nm，一般检测时选用460nm。
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