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- 产品描述
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服务介绍
原核蛋白表达系统是一种常用的表达系统，其中以大肠杆菌表达系统最具代表性。大肠杆菌表达系统是最早被应用的蛋白表达系统，也是目前掌握最为成熟的表达系统。大肠杆菌具有遗传背景清晰，成本低，表达量高，表达产物的分离纯化相对简单等众多优势，能快速表达不同种属来源的外源基因。但原核表达体系也存在易形成包涵体和含有内毒素等问题，瑞源生物可提供从密码子优化、蛋白表达、包涵体复性到标签去除等一站式服务，同时可提供内毒素含量检测服务。
技术原理
原核蛋白表达体系的基本原理在于利用原核生物强大的转录和翻译能力，将外源基因插入到合适的载体中，并通过特定的方法（如电穿孔、热激转化等）将载体导入原核细胞。在细胞内，载体上的启动子序列会被原核细胞的RNA聚合酶识别并启动转录过程，生成mRNA。随后，mRNA作为模板指导核糖体在原核细胞中进行翻译，最终合成目标蛋白质。
技术优势
1、严格使用空载质粒作为对照组，排除载体自身导致的表达情况
2、分别使用两个温度（28℃和37℃）进行表达鉴定，选取最佳诱导表达温度
3、对诱导前、诱导后的菌株上清及沉淀均进行检测与鉴定
4、洗脱过程中选择四个梯度的洗脱液进行洗脱，确保最佳洗脱浓度
实验流程
样品要求
类型
送样标准
运输条件
需要基因合成的序列
无
无
构建好的质粒
中间载体质粒
浓度>100ng/ul，体积>20ul；提供载体序列和抗性，无污染。
冰袋
含构建好质粒的菌液
含中间载体质粒的菌液
体积>500ul；提供载体序列和抗性，无污染。
干冰，1天（5kg）2-3天（10-20kg）3-5天（20-30kg）
平板菌
无污染
常温
注：除pET28a、pGEX-6P-1、pET32a载体外，其余载体需要客户提供空载体质粒或者菌液，以及空载体的载体图谱。
服务内容
服务流程 工作日
交付材料 表达小试 客户下单 10个
1、表达质粒（2ug左右）
2、标准的蛋白表达服务报告。
基因合成及密码子优化 载体构建 表达小试（SDS-PAGE鉴定） 14个
表达纯化 放大表达1L（SDS-PAGE鉴定/WB鉴定） 10个
1、蛋白（实际结果交付）
2、标准的蛋白表达服务报告。
案例报告
1、表达小试结果
挑选上述保存的正确的克隆用于表达小试。表达结束后，吸取20 μl待检测样品，加入5 μl 5×蛋白loading buffer，混匀后于100℃煮沸5-10 min，吸取20 μl进行SDS-PAGE鉴定。结果如下（图1和图2）。
图1 SDS-PAGE检测
SDS-PAGE检测目的蛋白表达情况。M：Maker，1：28℃空载体未诱导样品，2：28℃空载体诱导样品，3：28℃重组载体未诱导样品，4：28℃重组载体诱导样品，5：37℃空载体未诱导样品，6：37℃空载体诱导样品，7：37℃重组载体未诱导样品，8：37℃重组载体诱导样品
图2 SDS-PAGE检测
SDS-PAGE检测目的蛋白表达情况。M：Maker，1：28℃未诱导样品上清，2：28℃未诱导样品沉淀，3：28℃诱导样品上清，4：28℃诱导样品沉淀，5：37℃未诱导样品上清，6：37℃未诱导样品沉淀，7：37℃诱导样品上清，8：37℃诱导样品沉淀
2、放大表达结果
对放大表达的样品进行SDS-PAGE与WB鉴定检测，结果如下（图3、图4）。
图3 SDS-PAGE检测
SDS-PAGE检测目的蛋白表达情况。M：Maker，1：诱导前全菌，2：诱导后全菌，3：上清，4：沉淀，5：流穿液，6：50 mM洗脱样品，7：100 mM洗脱样品，8：300 mM洗脱样品，9：500mM洗脱样品
图4 WB检测
WB检测目的蛋白表达情况。M：Maker，1：洗脱样品，2：阳性对照
常见问题及解答
1、什么情况下应选择大肠杆菌表达系统
原核表达体系适用于表达原核来源的蛋白或不需要翻译后修饰的真核来源蛋白，特别是小分子蛋白。
2、蛋白表达不理想
蛋白明显降解、表达为包涵体、二硫键错误折叠、过高的本地表达等
可采取以下方式解决：
优化表达条件，如降低温度、减少诱导时间
1）基因优化、载体宿主优化筛选、表达条件（降低诱导温度等）方法，提高可溶蛋白比例
2）利用促进二硫键形成的表达载体减少二硫键错误折叠
3）选择合适的菌株载体组合，减少非诱导条件下的蛋白表达
3、纯化过程中蛋白失活
纯化过程中可能存在的物理、化学因素（如温度、pH值、离子强度等）对蛋白活性造成影响。
应优化纯化条件，如使用温和的缓冲液体系、控制纯化过程中的温度和时间等。同时，在纯化过程中保持蛋白的稳定性也非常重要，可以通过添加稳定剂（如甘油、糖等）来实现
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