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    双分子荧光互补实验（BiFC）

    双分子荧光互补（Bimo-lecular fluorescence complementation，简称BiFC），将荧光蛋白分割成两个不具有荧光活性的分子片段（N-fragment、C-fragment），将这两个荧光蛋白的片段分别融合两个目标蛋白A、B，如果A与B蛋白发生了相互作用，在空间上互相靠近，就会重新构建成完整的具有活性的荧光蛋白分子，在激发光的激发下，荧光蛋白发出荧光。反之，若A与B蛋白之间没有相互作用，则不能被激发岀荧光。

    所属分类

    常规分子生物学平台

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    • 产品描述

    • 技术原理

      双分子荧光互补（Bimo-lecular fluorescence complementation，简称BiFC），将荧光蛋白分割成两个不具有荧光活性的分子片段（N-fragment、C-fragment），将这两个荧光蛋白的片段分别融合两个目标蛋白A、B，如果A与B蛋白发生了相互作用，在空间上互相靠近，就会重新构建成完整的具有活性的荧光蛋白分子，在激发光的激发下，荧光蛋白发出荧光。反之，若A与B蛋白之间没有相互作用，则不能被激发岀荧光。

       

      应用场景

       验证蛋白质之间是否存在相互作用，可与酵母双杂、Co-IP等实验结果相互验证；

       

      技术优势

      1. 适用于体内和体外蛋白相互作用的验证；
      2. 实验中的蛋白处于天然状态，并能直观观察蛋白相互作用在细胞中的定位；实验周期短；
      3. 相对于FRET和BRET技术对仪器的要求高、数据处理复杂的情况，BiFC只需要荧光倒置显微镜，数据处理简单，只检测荧光的有无，背景干净，检测更灵敏，不依赖于其他次级效应；
      4. 还可以用于研究蛋白之间的弱相互作用或瞬间相互作用；
      5. 不需要蛋白有特别的理论配比，能检测到不同亚群蛋白间的相互作用

       

      技术步骤

      1. 植物材料以及菌株的保存与培养

      2. 基因克隆及重组质粒的构建

      3. 大肠杆菌TOP10感受态的制备和转化

      4. 农杆菌GV3101感受态的制备和转化

      5. 农杆菌介导的瞬时表达体系

      6. 烟草叶片荧光检测

       

      材料样品处理与保存

      类型

      送样标准

      运输条件

      需要基因合成的序列

      无

      无

      构建好的质粒

      中间载体质粒

      浓度>100ng/ul，体积>20ul；提供载体序列和抗性，无污染。   

      冰袋

      含构建好质粒的菌液

      含中间载体质粒的菌液

      体积>500ul；提供载体序列和抗性，无污染。

      干冰，1天（5kg）2-3天（10-20kg）3-5天（20-30kg）

      平板菌

      无污染

      常温

       

      服务内容

      服务内容

      工作日

      交付材料
      1、亚细胞定位预测 ≤1 1、重组质粒一份
      2、重组质粒测序结果
      3、实验原始图片， 设置1组实验组、1组阳性对照、2组阴性对照。其中对照每组包含YFP、Bright field、Merge各1张，实验组拍摄3个视野，每个视野包含YFP、Bright field、Merge各1张。
      4、标准实验报告(含实验步骤、流程)

      2. 基因合成/载体构建

          A基因构建到

          pCAMBIA1300-nYFP、

          B基因构建到

          pCAMBIA1300-cYFP

      10个

      3. 烟草注射

      4. 烟草叶片荧光检测

      8个
      5. 数据整理

      2个

       

      服务说明

      1. 本实验默认在烟草中进行。

      2. 阳性对照组有荧光，而阴性对照无，则认为对照组正常，实验成功。

      3. 若阳性、阴性对照正常，且实验组检测到荧光则认为两个蛋白互作。

       

      案例展示

      图1 A与B在烟草中的互作情况

       

      参考文献

      1. Wenyuan Ruan,Meina Guo,Xueqing Wang, et al. Two RING-Finger Ubiquitin E3 Ligases Regulate the Degradation of SPX4, An Internal Phosphate Sensor, for Phosphate Homeostasis and Signaling in Rice. Molecular Plant. 2019;12 (8):1060-1074.

      2. Brett Burdo,John C. Gray,M. Paula Goetting-Minesky, et al. The Maize TFome – development of a transcription factor open reading frame collection for functional genomics. The Plant Journal. 2014;80 (2):356-366.

      3. Bin Ou,Kangquan Yin,Sai-Nan Liu, et al. A High-Throughput Screening System for Arabidopsis Transcription Factors and Its Application to Med25-Dependent Transcriptional Regulation. Molecular Plant. 2011;4 (3):546-555.

       

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