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瑞源医学
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- 产品描述
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服务简介
本项目提供"基因-蛋白表达-功能验证"一站式技术服务，提供从基因设计到蛋白表达，再到DNA结合功能验证，确保客户获得高纯度、高活性的目标蛋白及科学可靠的功能分析数据。
实验原理
利用哺乳动物细胞（如293T）表达目的蛋白，使其在胞内完成天然折叠和翻译后修饰，保持活性构象；再将标记的核酸探针与含目的蛋白的提取物孵育，在非变性凝胶中电泳。游离探针分子量小、迁移快，而蛋白-探针复合物分子量大、迁移慢，形成滞后的迁移条带（Shift band），据此直接判定蛋白与核酸的结合。
技术路线
服务优势
1、高表达：转染效率高，快速获得目标蛋白。
2、一站式服务：从基因设计、蛋白表达纯化到互作验证全程覆盖。
3、灵活性高：支持多种表达条件优化（温度、诱导时间等）。
4、数据可靠：实验报告包含原始数据、图表及详细分析说明。
应用场景
1、验证转录因子是否直接结合启动子/cis元件。
2、明确野生型与突变型探针以及野生型与突变型蛋白的具体结合位点。
3、分析辅因子加入后对结合的增强或抑制。
服务内容
服务内容 自然日 交付材料 1、基因合成/载体构建 15个 1、表达质粒2 μg左右）；
2、探针（如果用完则不返还）；
3、实验相关原始图片：
蛋白表达SDS-PAGE鉴定图片、蛋白表达WB鉴定图片、EMSA验证图片；
4、标准实验流程报告。
2、293T表达、鉴定 15个 3、探针设计、探针合成
（探针长度<60 bp）
7个 4、EMSA 7个 收样标准
类型 送样标准 运输条件 细胞 T25瓶（活率>95%）或冻存细胞（>1×106 cells） 1、T25瓶细胞使用常温或冰袋运输，不可使用干冰，T25瓶封口膜密封，填充新鲜培养基充满容器 > 90%体积，固定后选择最快运输方式进行寄送。若冰袋运输，注意细胞面远离冰袋。
2、对于长距离或无法保证快速运输的情况，强烈建议-80℃冻存细胞后干冰寄送
菌液 提供抗性，菌液量>0.5 mL，放置一年以上的甘油菌需活化后送样 菌液使用干冰寄送；
干冰使用量：1天（5 kg）、2-3天（10-20 kg）、3-5天（20-30 kg）
质粒 提供抗性，质粒量>20 μg 质粒使用冰袋寄送 平板菌 无污染 常温寄送 注意：干冰取样及运输，至少在送样前2天通知我司。 案例报告
1、蛋白表达结果
表达结束后，吸取20 μL待检测样品，加入5 μL 5×SDS loading buffer，混匀后于100℃煮沸5-10 min，吸取20 μL进行考染与WB检测。结果如下（图 1）：
图 1 蛋白纯化图片
A. SDS-PAGE检测，M：Marker，1-2：纯化前、纯化后。
B. WB鉴定，M：Marker，1-2：纯化前、纯化后。
2、EMSA结果分析
图 2 竞争型EMSA
结果：探针与蛋白有迁移条带，50×冷竞争探针能够竞争掉绝大部分探针即迁移条带很浅，突变探针与蛋白没有迁移条带，证明探针与蛋白是特异性结合。表明蛋白可直接与探针结合。
图 3 验证型EMSA
结果：相比于阴性对照组（仅加入野生型探针，1 号泳道），实验组（2 号泳道中）蛋白和探针显示出明显迁移速率变慢的现象（图 3）。表明蛋白可直接与探针结合。
常见问题
Q：竞争型 EMSA 实验中设置每组的作用是什么？
A：竞争型 EMSA 实验会有以下组合：
（1）阴性对照（只含标记探针）：确定只有探针的存在；
（2）常规实验组（蛋白+标记探针）：看蛋白和探针是否结合；
（3）探针冷竞争组（蛋白+标记探针+标记探针 10/50 倍的未标记探针）：若冷探针的加入能够与标记探针竞争，则说明蛋白和探针的结合是特异的；
（4）突变探针的冷竞争组(含蛋白+突变探针)：突变探针因为突变因此不能与标记探针竞争。
Q：观察不到迁移条带是什么原因？
A：
（1）蛋白样品中不存在与探针结合的蛋白；
（2）曝光时间过短；
（3）探针标记量少、探针被降解；
（4）蛋白样品中蛋白量过低或蛋白降解。
参考文献
[1] Gavarini S, Cayrol C, Fuchs T, Lyons N, Ehrlich ME, Girard JP, Ozelius LJ. Direct interaction between causative genes of DYT1 and DYT6 primary dystonia. Ann Neurol. 2010 Oct;68(4):549-53. doi: 10.1002/ana.22138. PMID: 20865765; PMCID: PMC3038652.
[2] Su, X., Liu, X., Ni, L., Shi, W., Zhu, H., Shi, J., Chen, J., Gu, Z., Gao, Y., Lan, Q., Huang, Q."GFAP expression is regulated by Pax3 in brain glioma stem cells". Oncology Reports 36, no. 3 (2016): 1277-1284. https://doi.org/10.3892/or.2016.4917.
[3] S. Kurachi, J.S. Huo, A. Ameri, K. Zhang, A.C. Yoshizawa, & K. Kurachi, An age-related homeostasis mechanism is essential for spontaneous amelioration of hemophilia B Leyden, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (19) 7921-7926, https://doi.org/10.1073/pnas.0902191106 (2009).
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