科研服务
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瑞源医学
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- 产品描述
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服务简介
Pull-down 实验是一种在体外验证蛋白质-蛋白质之间直接物理相互作用的经典方法。本项目提供"基因-蛋白表达-功能验证"一站式技术服务，提供从基因设计到蛋白表达，再到互作验证，确保客户获得高纯度、高活性的目标蛋白及科学可靠的功能分析数据。
实验原理
将诱饵蛋白与亲和标签（如GST）融合，利用标签与固相基质（如谷胱甘肽树脂）的特异结合将其固定；然后让含猎物蛋白的溶液流经基质，若两者直接结合，猎物即被“拉”住并保留，不结合的蛋白随洗涤液流出；最后通过改变洗脱条件（如加过量谷胱甘肽）回收结合复合物，用Western blot或质谱鉴定。该过程在体外完成，可直接证明两蛋白间的直接物理相互作用，排除其他分子的桥接干扰。
实验技术路线
服务优势
1、高效表达：快速获得目的蛋白材料。
2、接近哺乳细胞背景：更利于蛋白折叠与PTM。
3、便于标签纯化和富集：多种标签策略灵活选择。
4、互作验证直观：通过WB直接判断结合与否。
应用场景
1、验证候选蛋白是否发生直接或稳定的结合。
2、比较野生型与突变体诱饵蛋白的结合差异。
3、分析不同处理条件对结合的影响。
4、研究蛋白复合物形成及关键结构域作用。
服务内容
服务内容 自然日 交付材料 1、载体构建工作
A、基因合成（密码子优化）
B、基因合成（密码子不优化）
C、目的基因测序+载体构建
D、甲方已将目的基因构建 至表达载体，目的基因测序验证
15个 1、表达质粒（2 μg左右）
2、实验相关原始图片：蛋白表达SDS-PAGE鉴定、WB鉴定图片、pull down WB鉴定图片
3、标准的蛋白表达服务报告。
2、293T蛋白表达、鉴定 15个 3、pull down一对一验证
A、Western blot
B、平衡树脂
C、蛋白互作试验
D、Western blot验证
12个 收样标准
类型 送样标准 运输条件 细胞 T25瓶（活率>95%）或冻存细胞（>1×106 cells） 1、T25瓶细胞使用常温或冰袋运输，不可使用干冰，T25瓶封口膜密封，填充新鲜培养基充满容器 > 90%体积，固定后选择最快运输方式进行寄送。若冰袋运输，注意细胞面远离冰袋。
2、对于长距离或无法保证快速运输的情况，强烈建议-80℃冻存细胞后干冰寄送
菌液 提供抗性，菌液量>0.5 mL，放置一年以上的甘油菌需活化后送样 菌液使用干冰寄送；
干冰使用量：1天（5 kg）、2-3天（10-20 kg）、3-5天（20-30 kg）
质粒 提供抗性，质粒量>20 μg 质粒使用冰袋寄送 平板菌 无污染 常温寄送 注意：干冰取样及运输，至少在送样前2天通知我司。 案例报告
1、蛋白表达结果
表达结束后，吸取20 μL待检测样品，加入5 μL 5×SDS loading buffer，混匀后于100℃煮沸 5-10 min，吸取20 μL进行考染与WB检测。结果如下（图 1、2）：
图1 His-A蛋白纯化图片
A. SDS-PAGE检测，M：Marker，1-2：纯化前、纯化后。
B. WB鉴定，M：Marker，1-2：纯化前、纯化后。
图2 Flag-B蛋白纯化图片
A. SDS-PAGE检测，M：Marker，1-2：纯化前、纯化后。
B. WB鉴定，M：Marker，1-2：纯化前、纯化后。
2、pull down结果分析
在Input样品中His-A与Flag-B均可鉴定到信号，在用His进行IP结果中，His无法结合Flag-B，His-A可以结合Flag-B，说明His-A在体外可以与Flag-B直接结合（图3）。
图3 pull down验证A与B互作情况
pull down检测His-A和Flag-B。用His标签琼脂糖珠进行IP实验，anti-Flag抗体检测B，anti-His抗体检测A、His。
Pull-down/ Co-IP / CETSA / LCA 的简要区别
技术 体系 主要验证内容 Pull-down 体外（无细胞） 证明直接物理结合，排除第三方桥接 Co-IP 细胞内 检测生理条件下蛋白复合体，可能有间接互作 CETSA 活细胞 检测药物-靶蛋白在细胞内的结合（通过热稳定性） LCA 活细胞 对蛋白质互作可进行定性+定量
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