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瑞源医学
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- 产品描述
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服务简介
原核生物CRISPR基因敲除通过Cas9/sgRNA复合物定点切割与同源重组修复联合实现。Cas9在sgRNA引导下识别靶基因PAM（5'-NGG-3'）序列并产生DNA双链断裂（DSB）；因原核生物普遍缺乏高效的非同源末端连接（NHEJ）系统，未修复的DSB导致细胞死亡，形成强烈的致死负筛选背景。同时提供含有靶位点两侧同源臂（200–500 bp）的修复模板，在重组系统或宿主介导下，通过同源重组将靶基因替换为抗生素抗性标记或直接实现无痕缺失，从而获得阳性敲除株。
服务优势
1、效率极高：DSB致死效应确保存活菌落几乎均为重组编辑株，阳性率可达90%以上。
2、可无痕编辑：通过设计直接缺失同源臂实现基因组“干净”缺失，不引入外源抗性或疤痕序列，可连续迭代敲除。
3、多重编辑能力强：同时导入多个sgRNA和对应修复模板，一次实验完成多基因或大片段敲除。
4、广泛适用：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌、蓝细菌等均有成熟应用，仅需调控Cas9表达条件。
应用场景
1、基因功能解析：快速构建单基因或多基因缺失文库，筛选关键表型相关基因。
2、工业菌株改良：敲除产噬菌体受体、产孢、细胞自溶或不利应激因子，提升发酵稳定性和产量。
3、药物靶标验证：在病原原核生物中敲除候选必需基因或耐药基因，评估杀菌靶点。
4、信号通路与调控网络研究：缺失双组分系统、全局转录因子，解析调控机制。
服务内容
服务内容 自然日 交付材料 质粒验证 1、提供序列
2、提供质粒：测序验证
15个 1、敲除成功的菌株甘油菌、平板;
2、测序文件；
3、电子版实验报告1份。
基因敲除 1、CRISPR靶点设计
2、敲除模块构建
3、载体构建与质粒提取
4、化学转化与电转化
5、PCR验证
6、测序鉴定
7、阳性克隆扩增
8、结果鉴定
56个 收样标准
类型 送样标准 运输条件 需要基因合成的序列 无 无 构建好的/
中间载体质粒
浓度>100 ng/uL，体积>20 uL；提供载体序列和抗性，无污染。 质粒使用冰袋寄送 含构建好质粒/
含中间载体质粒的菌液
提供抗性，菌液量>0.5 mL，放置一年以上的甘油菌需活化后送样。 菌液使用干冰寄送，干冰使用量：1天（5 kg）2-3天（10-20 kg）3-5天（20-30 kg） 平板菌 无污染 常温 注意：1、其余类型样品请提前与我司沟通；
2、干冰取样及运输，至少在送样前2天通知我司。
案例报告
1、转化生长情况
电转化后平板可见密集单菌落，长斑正常（图 1）。
图 1 转化平板
2、PCR鉴定结果
PCR 鉴定位点如下图所示（图2）。
图 2 PCR 鉴定结果
2、测序结果
测序结果显示目标区域被精确删除，上下游同源臂正确连接（图 3）。
图 3 敲除测序验证
4、表型筛选
敲除菌株在含卡那霉素的 LB平板上正常生长，而野生型菌株无生长（图 4），验证筛选标记功能。
图 4 表型筛选
参考文献
[1] Pickar-Oliver A, Gersbach CA. The next generation of CRISPR-Cas technologies and applications. Nat Rev Mol Cell Biol. 2019;20(8):490-507. doi:10.1038/s41580-019-0131-5
[2] Hryhorowicz M, Lipiński D, Zeyland J, Słomski R. CRISPR/Cas9 Immune System as a Tool for Genome Engineering. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 2017;65(3):233-240. doi:10.1007/s00005-016-0427-5
[3] Wang SW, Gao C, Zheng YM, et al. Current applications and future perspective of CRISPR/Cas9 gene editing in cancer. Mol Cancer. 2022;21(1):57. Published 2022 Feb 21. doi:10.1186/s12943-022-01518-8
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