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    了解酵母杂交那些事,这篇文章就够了


    酵母杂交那些事

    在所有的生命活动中,

    蛋白质是最终的执行者和体现者,

    并且随着大量生物基因组测序的完成,

    越来越多研究人员将重点转移到蛋白组的研究上。

     

    传统酵母单双杂交技术

    许多真核生物的转录激活因子均具有2个功能上独立的结构域———DNA 结 合 结 构 域 (DNA-binding domain BD) 和 DNA 激活结构域(Activation domain AD),前者特异结合于顺式作用元件上,后者实施基因表达调控功能,因此 DNA结合结构域和DNA激活结构域就可以分开使用,单独的结合结构域或转录激活结构域都不能启动下游报道基因的表达。

    酵母单杂交技术是一种体外研究DNA与蛋白质相互作用的技术,利用此原理构建各种基因与转录激活域融合的融合蛋白,只要转录激活域所融合的蛋白能与特异的DNA序列结合,也就是说它能够扮演转录因子结合结构域的功能,那么就会形成有功能的转录因子,从而实施基因表达调控,激活启动子下游报道基因的表达。人们用于酵母单杂交系统的酵母GAL4蛋白即是一种典型的转录因子。

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    Gal4 有两个不同功能域即:N 端 DNA 结合域(DNA-BD)和 C 端(转录)激活域(AD),两个单独的域均独立于另一个而维持其功能。在诱饵蛋白上加上BD 结构域,在猎物蛋白上加上 AD 结构域,当诱饵和猎物结合时,BD 和 AD 结构域在空间上相互接近,发挥转录因子的作用。DNA-BD 结构域识别并结合 GAL 上的 UAS(上游激活序列), AD结构域激活基因转录,从而使酵母特定基因如 LzcZ、HIS3、MEL1、ABAr 的表达,使酵母菌能够在特定的营养缺陷培养基上生长,同时水解培养基上的 X-α-Gal,使无色透明的 X-α-Gal分解从而使菌落产生蓝斑,降低了假阳性率;也可通过 AbA 抗生素筛选报告基因的表达而在抗生素培养基上生长,提高了准确性。

     

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    1986 年 Keegan 等发现了酵母细胞中的Gal4 结构可结合特定的 DNA序列(上游激活域,UAS),从而在半乳糖存在的情况下激活转录。1989 年,Fields 和 Song 通过描述一种基因 系 统 来 检 测  酵 母 ( Saccharomyces cerevisiae)中直接的蛋白质-蛋白质相互作用,彻底改变了蛋白质相互作用分析,酵母双杂交系统是研究活细胞内蛋白质与蛋白质之间相互作用的一种强大且常用的分子生物学技术,该技术不仅能够检测细胞内稳定的蛋白互作,而且可以检测微弱的或者瞬时的蛋白相互作用。从cDNA文库中寻找与已知蛋白相互作用的未知蛋白是酵母双杂交技术最为重要的用途。

     

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    NGS测序

    要阐明蛋白之间所有的相互作用关系,并不是一件容易的事情,根据最新的理解,人类基因组中一共有大约17500条编码蛋白质的基因,单是测试一轮,就有3亿(17500乘以17500)多种不同的可能性。而为了实验的准确性,研究人员们使用了三种不同的酵母体系,且在每一个体系里,都将这个实验重复了3遍。这样一来,他们所做的单独测试多达约30亿个。

    高通量测序技术是一次能对几十万到几百万条核酸分子进行序列测定的技术。该技术通过将DNA随机片段化、加接头,制备测序文库,通过对文库中数以万计的克隆进行延伸反应,检测对应的信号,最终获取序列信息。

     

    富集分析

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    高通量的数据的分析,可以让我们得到很多候选的结果。但是如果只是把结果这样的平铺开的话,反正不利于我们去发现事情的本质。所以为了看清楚这些基因的功能,我们就使用了富集分析。我们可以把富集分析理解为在把很零零碎碎的东西,通过一个整体来反应出来,类似于从微观到宏观的变化。

    利用富集分析,我们就可以把很多看着杂乱的差异基因总结出一个比较整体反应事件发生的概述性的句子。例如:TP53信号通路和胃癌的发生有关。而不是说BAX、BID、ABL1、ATM、BCL2、BOK、CDKN1A这7个基因和胃癌的发生有关系。

    对于每个基因而言,其基本的功能基于他们的蛋白结构域以及研究的文献已经可以大致的知道一个基因具有什么样子的功能了。GO和KEGG就是基于不同的分类思想而储存的基因相关功能的数据库。下面我们来了解一下什么是GO和KEGG数据库。

    GO数据库,全称是Gene Ontology(基因本体),他们把基因的功能分成了三个部分分别是:细胞组分(cellular component, CC)、分子功能(molecular function, MF)、生物过程(biological process, BP)。利用GO数据库,我们就可以得到我们的目标基因在CC, MF和BP三个层面上,主要和什么有关。

     

    GO富集分析

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    KEGG数据库:分析基因产物和化合物在细胞中的代谢途径以及这些基因产物的功能的数据库。

     

    KEGG富集分析

     

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    通过上面的解释,我们知道,其实GO和KEGG是两个数据库,里面有每个基因相关的功能信息,而富集分析就是一个把这些功能进行进行整合计算的算法。GO和KEGG是基础,而富集是过程,最后得到的结果就是整合后的宏观的结果。

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    了解酵母杂交那些事,这篇文章就够了

    许多真核生物的转录激活因子均具有2个功能上独立的结构域———DNA 结 合 结 构 域 (DNA-binding domain BD) 和 DNA 激活结构域(Activation domain AD),前者特异结合于顺式作用元件上,后者实施基因表达调控功能,因此 DNA结合结构域和DNA激活结构域就可以分开使用,单独的结合结构域或转录激活结构域都不能启动下游报道基因的表达。


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