最近加入的商品:

    0 件商品 合计 0

    资源中心

    技术服务手册,科研文献解读,最新文献下载

    重组抗体在哺乳动物细胞中的表达


    抗体可以通过哺乳动物细胞产生,也可以通过刺激动物免疫系统产生,本文主要介绍了两种抗体的产生方法及其区别。

     

    单抗和多抗定义

    蛋白质表面上能让免疫系统产生抗体的区域称为抗原决定簇(也称为表位,见下图)。一般由6-12个氨基酸或碳水基团组成,可由连续序列或不连续的蛋白质三级结构组成。一个抗原可以存在许多不同的抗原决定簇,所以机体可以产生许多不同的抗体。由单个B淋巴细胞产生的只识别特定表位的抗体被称为单克隆抗体。由多种B细胞产生的、受多种抗原决定簇刺激的、能够结合多种表位的抗体称为多克隆抗体。单抗与多抗的区别可参考单抗与多抗的区别。重组抗体的生产是根据基因序列来得到单抗,通过构建稳定表达的细胞系来满足抗体量的生产。

    1

    抗原决定簇

    重组抗体和免疫抗体技术制备

    抗体可以通过两种方式生产。①使用重组蛋白获得接近自然条件下的重组蛋白(或多肽),然后刺激动物免疫系统我们便可以获得抗体。②使用哺乳动物细胞同样可以生产抗体,只要我们提前获知抗体的基因序列,之后将基因序列克隆到相应载体上进行重组抗体的表达。通过刺激动物免疫系统我们可以生产单抗和多抗,并且这种方法效率高成本较低,但是通过序列来进行重组抗体表达的话,只能生产特定基因的单抗。这两种生产方式在作用原理和过程上存在一定的差异和联系,具体如下:

    1

    哺乳动物细胞重组抗体生产

    1

    刺激动物免疫系统制备单抗

    两种方式制备单抗综述:

    抗原的制备:通过不断刺激动物免疫系统来生产单抗前提是要获得抗原,抗原可以是可溶性蛋白或者多肽。可溶性蛋白可以通过重组蛋白生产得到。多肽作为一个抗原与载体偶联免疫小鼠,可以用多肽进行抗体筛选,如不能进行抗体筛选,需偶联另一种载体进行有效筛选;

    免疫动物:实验一般根据自己的实验方案操作,免疫动物通常选择6周龄的小鼠。用已制备的抗原免疫小鼠,让其分泌B淋巴细胞,用于下一步融合;

    细胞融合:实验前准备骨髓瘤细胞,将骨髓瘤细胞同B淋巴细胞按一定比例融合形成杂交瘤细胞;

    杂交瘤细胞的选择和培养筛选: 采用HAT筛选①培养基筛选融合成功的杂交瘤细胞;

    融合细胞的单克隆生长鉴定:使用有限稀释法或其他方法都可以进行杂交瘤细胞的克隆培养,通过鉴定最终可以得到具有生产单克隆抗体能力的阳性杂交瘤细胞。

    哺乳动物重组抗体在以上工作流程的基础上进行:

    稳定表达细胞系的构建: 利用上述实验获得抗体测序并使用得到的抗体序列,用哺乳动物细胞产生重组抗体来进行表达,筛选稳定表达的细胞系。

    大规模生产单克隆抗体:选择稳定生产的细胞系,满足后续需要大量抗体的要求,节省后续实验时间。

    制备单抗的原理

    重组抗体在哺乳动物细胞中的表达

    传统生产抗体的方式是用抗原刺激动物的免疫系统,这种生产方式需要先制备抗原,且利用这种生产抗体方法产量不高,难以实现大批量的生产(需要提供大量的实验耗材和时间)。而哺乳动物细胞生产抗体的方式具有一定的优势。①已知抗体的基因序列,将序列克隆到表达载体上,然后导入到哺乳动物细胞体内进行培养,通过建立一系列的筛选简单最终我们可以获得能够稳定生产这种抗体基因的稳定细胞系,虽然这一工作过程需要使用大量的时间,才能筛选出足够稳定表达的细胞系,但是能够在后续实验中稳定长期生产。②未知序列的抗体大量产品生产,需要先刺激动物免疫功能系统来得到少量抗体,然后通过测序得到抗体序列,通过哺乳动物细胞重组抗体表达筛选出稳定表达的细胞系,满足大量的生产需求。

    刺激动物免疫系统制备抗体

    抗原准备与抗原刺激动物免疫系统,抗原处理的B细胞与骨髓瘤细胞进行融合,融合后产生的细胞具有B细胞合成专一抗体的特点,也可以无限增殖(B淋巴细胞不能再在体外生长,但杂交瘤技术的应用可以使他们在体外无限增殖)。HAT筛选后,融合成功的细胞在体外或在体内腹水培养,单克隆生长,最后用于抗体检测。刺激动物免疫系统产生抗体需要制备抗原,这些抗原可以通过重组蛋白生产获得,因此我们首先要获得抗原,然后再产生抗体。

    HAT培养基筛选杂交瘤细胞的原理

    杂交瘤细胞

    细胞融合是一个随机过程。融合后可能出现的细胞有杂交瘤细胞,融合的脾细胞和脾细胞,融合的肿瘤细胞和肿瘤细胞,未融合的脾细胞,未融合的肿瘤细胞和细胞聚集体。那你怎么将杂交瘤细胞筛选出来呢?对于正常脾细胞,其在培养基中的存活时间为7-14天,因此不需要特殊筛选,细胞聚合物也容易死亡,只有非融合的肿瘤细胞需要特殊筛选来去除。

    因此我们选择的培养基中有三种关键成分:次黄嘌呤(hypoxanthine,H),氨基喋呤(aminopterin,A),胸腺嘧啶脱氧核苷(thymidine,T),故称为HAT培养基。

    细胞DNA合成有两个重要途径:

    A.主要途径:用糖、磷酸、氨基酸、二氧化碳、NH3等化合物来合成核苷酸,再由核苷酸合成DNA,叶酸是重要的辅酶参与了这个合成过程。氨基喋呤是一种叶酸的拮抗物,通过这一途径可以阻断杂交瘤和瘤细胞合成核苷酸。

    B.应急途径:在次黄嘌呤和胸苷核苷存在下,DNA合成由次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸转移酶(HGPRT)和胸苷核苷激酶(TK)催化。 然而,由于肿瘤细胞具有这两种酶的缺陷,它们不能在HAT培养基上生长,不能合成或分泌免疫球蛋白,并且只有融合杂交瘤细胞具有脾细胞和肿瘤细胞的遗传特性。 DNA可以通过紧急途径合成,以及在HAT培养基中长期存活、增殖和分泌抗体。

    相关内容


    酵母技术在抗逆基因表型验证中的应用

    酵母是一种单细胞真核微生物,具有快速繁殖、基因组较小、遗传操作方便等特点,被广泛用作模式生物,研究其在不同逆境条件下的基因表达和功能。非生物胁迫包括对生物生长和发育不利的环境因素,如高温、低温、高盐、低氧、重金属、药物等。非生物胁迫条件下,酵母会启动应激反应,调节基因表达,增强抗逆性。


    了解酵母杂交那些事,这篇文章就够了

    许多真核生物的转录激活因子均具有2个功能上独立的结构域———DNA 结 合 结 构 域 (DNA-binding domain BD) 和 DNA 激活结构域(Activation domain AD),前者特异结合于顺式作用元件上,后者实施基因表达调控功能,因此 DNA结合结构域和DNA激活结构域就可以分开使用,单独的结合结构域或转录激活结构域都不能启动下游报道基因的表达。


    Y2H玩转抗体筛选

    抗体在细胞内的表达已成功用于消除蛋白质功能。这一发现表明,该技术应对疾病治疗和功能基因组学有影响,其中预测功能未知的蛋白质基因组序列。一个主要的障碍是一些抗体在真核细胞中不起作用,大概是因为抗体在细胞质中不正确地折叠。为了克服这个问题,我们已经开发了一种使用酵母双杂交体系用于筛选细胞内功能抗体的方法。我们发现几种特征抗体在真核细胞中以双杂交形式结合它们的靶抗原,我们已经能够从在体外结合抗原的scFv组中分离细胞内结合的物质。


    重组抗体在哺乳动物细胞中的表达

    蛋白质表面上能让免疫系统产生抗体的区域称为抗原决定簇(也称为表位,见下图)。一般由6-12个氨基酸或碳水基团组成,可由连续序列或不连续的蛋白质三级结构组成。一个抗原可以存在许多不同的抗原决定簇,所以机体可以产生许多不同的抗体。由单个B淋巴细胞产生的只识别特定表位的抗体被称为单克隆抗体。由多种B细胞产生的、受多种抗原决定簇刺激的、能够结合多种表位的抗体称为多克隆抗体。单抗与多抗的区别可参考单抗与多抗的区别。重组抗体的生产是根据基因序列来得到单抗,通过构建稳定表达的细胞系来满足抗体量的生产。


    酵母蛋白表达系统

    酵母表达系统是蛋白质真核表达的常用系统之一,具有真核表达系统的许多优点,如蛋白质加工和折叠、翻译后修饰等。酵母蛋白表达的操作与哺乳动物相比相对简单。 巴斯德毕赤酵母的表达水平高于酿酒酵母,细胞可以高密度培养。巴斯德是近年来发展起来的一种较为完善的表达体系,通常用来表达外源蛋白的甲醇营养型酵母表达系统。


    抗体分子基本结构

    抗体是一种由B淋巴细胞产生的免疫球蛋白。所有的抗体分子都具有相似的结构,由四个对称的肽链结构组成,由两个相同的重链(重链、H链)和两个相同的轻链(轻链、L链)组成。轻链和重链的内部和链之间分别由二硫键连接。