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    工程菌构建:关于PCR,你知道多少?酵母也可以菌落PCR了


    一、PCR技术的原理

    PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成:

    1、模板DNA的变性

    模板DNA经加热至95℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;

    2、模板DNA与引物的退火(复性)

    模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;

    3、引物的延伸

    DNA模板-引物结合物在72℃、DNA聚合酶(如TaqDNA聚合酶)的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基互补配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链,重复循环变性-退火-延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2~4分钟,2~3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

     

    二、PCR系统的基本要素

    PCR反应五要素:参加PCR反应的物质主要有五种即:引物(PCR引物为DNA片段,细胞内DNA复制的引物为一段RNA链)、酶、dNTP、模板和缓冲液(其中需要Mg2+)。

     

    三、提高PCR反应特异性的措施

    PCR特异性 (specificity)是指PCR反应的产物只产生预期的靶序列,不含非目标靶序列的DNA片段。理想的PCR反应除了忠实性高,还应该体现为高度特异性和高效性,高效性是指经过相对较少的PCR循环能获得更多的产物。提高,PCR反应的特异性的措施有以下几方面:

    1、引物设计引物长度适当 

    引物长度一般为18~24bp,并保证序列独特性,以降低序列在非目的片段中存在的可能性。长度大于24bp的引物并不意味着有更高的特异性,较长的序列可能会与错误配对序列杂交,反而降低特异性,而且长序列比短序列杂交慢,影响产量。引物的浓度会影响特异性,引物浓度一般在0.1~0.5umol/L,较高的引物浓度会导致非特异性产物扩增。

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    2、提高退火温度PCR的退火温度

    退火温度设定一般由引物Tm决定,退火温度一般设定为比引物的Tm低5°C。在理想状态下,退火温度应足够低,以保证引物同目的序列有效退火,同时还要足够高,以减少非特异性结合,因此,需要找到这个温度的均衡点。采用梯度PCR仪可以对PCR反应的退火温度进行优化筛选,确定特异性较好的退火温度。

    3、合适的Mg2+浓度

    较高的Mg2+浓度可以增加产量,但也会降低特异性,为了确定合适浓度,可以将Mg2+浓度从1mmol/ L到3 mmol/ L, 以0.5mmol/L递增,进行Mg2浓度的测定。

    4、添加PCR辅助剂

    甲酰胺、DMSO、甘油、甜菜碱等都可充当PCR的增强剂,其可能的机理是降低熔解温度,从而有助于引物退火并辅助DNA聚合酶延伸通过二级结构区,但是增强剂浓度要适当,否则会降低PCR的产量。

    5、改进PCR策略

    通过改进PCR策略,如采用巢式PCR、融合PCR

     

    四、PCR常见问题及解决方式

    1、酵母菌落PCR技术

    问:酵母可以直接挑取单菌落进行PCR验证筛选?

    答: 当然可以

    01、传统观点

          1)酵母是一种重要的基因工程宿主菌,但是由于其细胞壁结构复杂牢固,普通的菌落PCR方法的成功率较低。        

          2)传统的酵母阳性菌株鉴定方法

             从抗性平板中挑选选转化子,提取酵母基因组,以基因组DNA作为模板,进行PCR扩增。

          3)传统鉴定方法的缺点

             目前市面上的酵母基因组提取在时间上需要摇菌扩培1天,提取酵母基因组需要半天时间,同时由于酵母质粒的拷贝数本来就低,即使提取出来,基因组浓度也很低,为后续做PCR鉴定提供的模板量少。 

    02、新的技术

          可以直接挑取单菌落进行PCR来验证筛选阳性转化子,瑞源生物这款试剂盒将是酵母菌构建人的福音了。

     

     

     

    2、PCR出现假阴性

    PCR 反应出现假阴性结果,无扩增条带的4个原因:

    01、模板  

          ① 模板中含有杂蛋白质;

          ②在提取制备模板时丢失过多,量不够;

          ※ 在酶和引物质量好时,不出现扩增带,在程序固定不变的情况下,模板的质量不高。

     

    02、酶失活

          需更换新酶,或新旧两种酶同时使用,以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或电泳时忘记加溴乙锭。

    03、引物   

          引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称,是 PCR 失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。对策为:

             ① 选定一个好的引物合成单位;

             ②引物应高浓度小量分装保存,防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分,导致引物变质降解失效。

             ③引物设计不合理,如,引物长度不够,引物之间形成二聚体等。

    04、物理原因

          变性对PCR 扩增来说相当重要,如,变性温度低,变性时间短,极有可能出现假阴性;退火温度过低,可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率,退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。

    3、 PCR 非特异性扩增带的原因与对策

    PCR 扩增后出现的条带与预计的大小不一致,或大或小,或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。可能出现的原因有以下几点:

        1)引物与靶序列不完全互补或引物聚合形成二聚体;

        2)Mg2+离子浓度过高、退火温度过低及PCR循环次数过多有关;

        3)其次是酶的质和量,往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现,酶量过多有时也会出现非特异性扩增;

        4)其对策有:

           必要时重新设计引物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量,适当增加模板量,减少循环次数。适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性,65℃左右退火与延伸)。

    4、PCR 反应出现片状拖带或涂抹带

    1)PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差,dNTP浓度过高,Mg2+浓度过高,退火温度过低,循环次数过多引起。

    2)其对策有:

       ①减少酶量,或调换另一来源的酶;

       ②减少dNTP的浓度。增加模板量,减少循环次数。

     

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