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    荧光定量常见问题解析


      1、SYBR-Green染料法与TaqMan荧光探针法,这两种荧光定量PCR方法有什么区别?

      SYBR-Green染料法:染料能够与双链结合,当PCR扩增的时候,能特异性地渗入DNA双链后,发射荧光信号,而不掺入链中的染料分子不会发射荧光信号,从而保证荧光信号与PCR产物的增加完全同步。适用于任何DNA,无需设计探针,采取双标准曲线法,实验周期短,结果重复性好,灵敏度高。

      TaqMan荧光探针法:PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,该探针为一寡核苷酸,两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。经验丰富的实验技术人员设计探针,对目标基因有高特异性,实验重复性好,相对于SYBR Green法,灵敏度更高。

      2、客户除了提供样品外,还需要提供哪些信息?

      样品类型:组织/细胞/RNA/cDNA;

      物种信息

      目的基因的序列、GeneBank编号;客户提供引物序列(需要备注序列来源,不保证能检测),或者直接提供引物;

      内参基因;对照组。

      3、提供对照组为什么还需要提供内参?

      很多客户都会有这样的疑惑,为什么我已经提供给你们对照组,为什么还要确定内参基因?

      在QPCR中,需要加入内参基因校准正,消除不同样本在RNA产量、质量以及逆转录上可能存在的差别,从而获得目的基因特异性表达的真正差异。在Q的实验数据分析中计算的是相对表达量,是以客户指定的样品为标准进行相对定量数据分析,而客户指定的样品即为对照组。

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