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    核定位组学助力核蛋白作用机制的研究—一种新的核蛋白筛选系统iNTT的构建


    核蛋白在调控mRNA转录和加工、DNA复制和表观遗传基因组修饰中发挥着关键作用。因此,监测核蛋白变化的能力不仅有助于识别重要的调控蛋白,而且有助于研究核蛋白的作用机制。然而,目前还没有开发出有效的方法。黑麦对各种生物和非生物胁迫具有很强的抗性;然而,由于其基因组的复杂性和基因组序列信息的缺乏,迄今为止很少有基因功能特征。

     

    1998年,Ueki等改进了酵母双杂交的方法,建立了一种简便有效的核蛋白筛选系统(NTT),NTT 系统首先被应用于人胚胎脑部细胞核蛋白的研究,分离到的蛋白经过鉴定绝大部分定位于细胞核。到2005 年,Moriguchi等第一次将NTT 系统应用于植物研究,用此系统从水稻三个不同的cDNA 文库中分离到684个独立的克隆,经鉴定这些克隆绝大部分定位在核内。

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    中国农业科学院作物科学研究所陈明与马有志课题组在BMC Genomics 发表了一篇题为An iNTT system for the large-scale screening of differentially expressed, nuclear-targeted proteins: cold-treatment-induced nucleoproteins in Rye (Secale cereale L.)的研究文章,该文献阐述了一个用于大规模筛选差异表达的核靶向蛋白的iNTT系统的构建用于筛选黑麦冷处理诱导的核蛋白(Secale cereale L.)

     

    关键词:Nuclear-targeted protein, iNTT system, Yeast selective system

     

     

    本研究构建的核蛋白筛选系统与已报道的系统相比筛选效率更高。利用此系统从cDNA 文库中分离编码核蛋白的基因,对于研究核蛋白的动态组成、了解核蛋白基因在调控细胞发育及其环境胁迫条件下的作用机制具有重要的意义。

     

     

    1、iNTT系统的构建和筛选效率 

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    图1 iNTT系统的载体和筛选效率 

     

    结果表明,使用pLexAD载体和我们的iNTT系统比使用pLexAD-NES载体和之前报道的NTT系统更有效地筛选转录因子基因。

     

    2、用iNTT系统鉴定黑麦冷响应核蛋白 

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    图2差异表达基因的GO富集分析

     

    利用GO分类法,对这106个已知蛋白根据生物过程(图2a)、细胞成分(图2b)和分子功能(图2c)进一步进行分类。按生物过程分类时,参与细胞过程的基因比例最大(19%,图2a)。

     

    3、黑麦4种冷诱导核蛋白的亚细胞定位分析

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    图3四个黑麦蛋白的核定位

     

    为了研究这4种蛋白的亚细胞定位,在CaMV35S启动子的控制下,将相应的全长cDNA序列融合到163hGFP基因的5´端,并将得到的4个重组质粒转化到洋葱表皮细胞中进行瞬时表达检测。如图3所示,含有用163hGFP构建的阳性对照质粒的转化子在整个细胞中检测到荧光(图3a);而在ScT1、ScT36、ScT133或ScT196转化的细胞中,仅在细胞核中检测到荧光(分别如图3b、c、d和e所示),表明这4种蛋白定位于细胞核。

     

     

    4、黑麦四个核蛋白基因的冷诱导表达模式

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    图4 4个黑麦核蛋白基因表达谱分析

    利用QRT-PCR分析低温处理后4个核蛋白基因的表达模式。如图4所示,四种核蛋白基因的转录本在冷处理后均呈高度上调。

     

    5、表型验证-核蛋白基因的过表达增加了转基因植物对低温胁迫的耐受性 

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    图5转ScT3转基因拟南芥的抗冻性和相对电导率

    RT-PCR实验证实,ScT36在T3转基因拟南芥株系中转录(图5a)。将3个独立的转基因拟南芥细胞系过表达ScT36进行冷冻分析。结果表明,过表达ScT36降低了转基因植物的冷害,提高了转基因植物的抗冻性。

     

    参考文献

    1.  Nigg EA. Nucleocytoplasmic transport: signals, mechanismas and regulation. Nature. 1997;386:779–87.

    2.  Theodore M, Kawai Y, Yang J, Kleshchenko Y, Reddy SP, et al. Multiple nuclear localization signals function in the nuclear import of the transcription factor Nrf2. J Biol Chem. 2008;283:8984–94.

    3.  Wu WW, Weaver LL, Panté N. Ultrastructural analysis of the nuclear localization sequences on influenza a ribonucleoprotein complexes. J Mol Biol. 2007;374:910–6.

    4.  Kumar A, Agarwal S, Heyman JA, Matson S, Heidtman M, et al. Subcellular localization of the yeast proteome. Genes Dev. 2002;166:707–19.

     

    原文链接:DOI 10.1186/s12864-016-2548-y

     

     

    小编有言

     

    iNTT系统可用于筛选新的核蛋白,研究核蛋白在生物和非生物胁迫下的动态组成,这类分析对于研究基因表达调控机制和分离治疗后的关键调控基因具有重要意义。本研究将改良的NTT系统与“后抑制减法”相结合,开发了一种新的核蛋白iNTT系统。在iNTT系统中,使用pLexAD载体来筛选cDNA文库,而不是以前在NTT系统中使用pLexAD-NES载体。在筛选NLS和GmAREB核蛋白时,iNTT系统比以往的NTT系统表现出更高的筛选效率。为了鉴定黑麦的耐温基因和温度响应基因,采用iNTT系统筛选了一个低温处理的黑麦cDNA文库;共鉴定出241个独特基因。选择4个核蛋白(ScT1、ScT36、ScT133和ScT196)进行进一步功能分析。亚细胞定位分析表明,4个候选蛋白均定位于细胞核内,Q-RT-PCR分析表明,4个候选蛋白在低温胁迫下均有较高水平的表达。过表达ScT1和ScT36可分别增强转基因植物对高温和低温胁迫的耐受性。总之,iNTT系统被证明对分离在各种处理条件下诱导的重要核靶向蛋白是有用的。

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