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    筛不到想要的基因?你真的清楚文库中有什么基因吗?文库构建后NGS测序帮你解决


    酵母cDNA文库

    酵母cDNA文库就像一个包含了物种绝大部分cDNA序列的仓库,这些cDNA构建到载体上并转入酵母菌内进行保存及后续实验。不同于基因组文库含有内含子,cDNA 文库便于克隆和大量表达。因此可以从 cDNA 文库中筛选到所需的目的基因,并直接用于该目的基因的表达。

    通过构建 cDNA 表达文库可以提供构建分子标记连锁图谱的所用探针 ,更重要的是可以用于分离全长基因进而开展基因功能研究。

     

    酵母cDNA文库质检方法

    但是完成酵母cDNA文库构建后,我们往往不知道哪些基因成功构建到了文库内?自己想要的基因是否成功构建?移码情况如何?空载率数据?对于文库的信息不能有清晰明确的认知。

    曾经的cDNA文库质检方法通过铺板培养计算库容,随机挑选24个克隆,进行PCR验证。但是通过这种方法只能知道基因的大致分布情况,对于文库中具体包含哪些基因,是否包含感兴趣的基因均不能体现。

    图1 传统cDNA文库质检

    全新文库质检方法

    全新酵母cDNA文库质检方法,酵母cDNA文库构建后,文库质粒进行NGS测序。测序结果可以体现出酵母cDNA文库覆盖率信息,有研究表明,合格的酵母cDNA文库占物种全部cDNA的覆盖率应在40%以上。测序结果还能清晰体现基因信息,一目了然体现文库质量,基因序列等信息并对后续实验具有指导意义。

    图2 通过NGS测序进行cDNA文库质检

     

    文献支撑

    南京农业大学宋爱萍团队发表文章Evaluation of a yeast two-hybrid library by high-throughput sequencing,文章表明通过高通量测序可以获得插入基因数、基因丰度等关键指标,还可以获得物种的基因序列,大大加快各物种蛋白互作的研究进程。

    PPIs(protein-protein interactions),也就是蛋白质互作。许多生物过程依赖蛋白质之间的相互作用,蛋白质互作是细胞生化反应网络的重要组成部分。近年来,蛋白质互作已经成为蛋白质组学研究的一个重要领域。

    酵母双杂(Y2H)不仅可以点对点验证蛋白质互作,并且可以从大量蛋白质中筛选出筛选互作的蛋白质文库。酵母双杂(Y2H)体系对蛋白质间微弱的相互作用高度敏感,被广泛用于鉴定蛋白质互作。

    酵母双杂体系在具备敏感度高、应用范围广的优点的同时,假阳性和假阴性是Y2H的主要缺点,避免假阳性和假阴性的有效方法是提高文库的质量。

    传统的文库质量评估方法只能告知我们文库的容量和非常有限的文库插入长度。文章开发了一种新方法,通过高通量测序评估文库质量,可以消除传统方法的随机性和片面性,可用于获得插入基因数量和基因丰度等关键指标,以有效评价文库的质量,减少酵母双杂交体实验假阳性和假阴性率。

     

    文库NGS测序流程

    实验流程:构建酵母文库质粒,进行测序,随后进行数据分析。可获得插入基因数、基因丰度等关键指标,测序结果将展现TF数量及位置信息。

    图3 利用酵母进行cDNA文库构建及测序示意图

     

    同时,得到测序数据后进行GO分析,对基因进行功能分类和注释,了解感兴趣的基因或蛋白在细胞中的位置,参与的生化反应和调控的生物学事件。

    图4 GO分析示意图

     

    进行KEGG富集分析,对基因参与的代谢通路和生物系统进行分析整合。将基因映射到不同的通路图中,展示了它们在生物体中的作用和联系。通过KEGG分析,我们可以了解我们感兴趣的基因或蛋白质如何与其他分子协同工作,完成各种生命过程和功能。

    图5 KEGG分析示意图

     

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