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    蛋白互作研究利器,一起谈谈酵母双杂(一)


    酵母双杂的目的是研究蛋白—蛋白间的互作。那么首先,我们先来了解一下蛋白互作。

    蛋白质是生命的基本组成单位,也就是我们常说的没有蛋白质就没有生命。蛋白质由氨基酸“脱水缩合”形成的多肽链折叠形成具有一定空间结构的物质。氨基酸的不同排列组合方式,以及蛋白质的不同空间构型都决定了蛋白质的种类是难以估计的。

    这些庞大的蛋白质家族并不是“单打独斗”发挥作用的,在参加生命活动的过程中,蛋白质相互间会共同作用形成蛋白复合物。这种蛋白质间的相互作用也就是“蛋白互作”。

    “蛋白互作”可以是强互作也可以是弱互作;可以是短暂的也可以是稳定的;可以说直接的也可以是间接的;可以是特异性的也可以是非特异性的。

    1989年,Fields提出酵母双杂交技术,以类似“锁-钥”模型,打开了“蛋白质-蛋白质”互作筛选的大门。

    研究蛋白互作可以对多种生物学问题进行分子机理层面的解释。研究蛋白互作的方法有多种,如pull-down、免疫共沉淀等,各种方法都有各自的适用范围及优缺点。其中酵母双杂是研究蛋白互作的一项标志性经典技术。

     

    酵母双杂技术原理

    基因的表达受转录因子的控制,转录因子由两部分结构域组成,一部分是BD(DNA结合域),另一部分是AD(转录激活域)。DNA结合域与启动子结合,转录激活域招募转录激活复合体,二者共同启动报告基因转录,产生mRNA。

    酵母双杂中,BD与诱饵蛋白基因被构建到pGBKT7质粒中,转化到酵母中产生BD-诱饵蛋白复合体。AD与猎物蛋白基因构建到pGADT7质粒中,转化到酵母中产生AD-猎物蛋白复合体。

    当诱饵蛋白与猎物蛋白能发生相互作用时,AD-BD在空间上能够充分接近,形成完整的转录因子结构域,诱导报告基因转录,翻译形成报告基因编码的蛋白。因此酵母能够在缺乏报告基因编码的蛋白的平板上正常生长。

     

    酵母双杂实验结果图怎么看

    在观察酵母双杂筛选图像时,我们可以先看双缺图像,双缺图像代表质粒是否成功转化进入酵母菌。是实验数据是否可靠的前提。

    再看四缺图像,图中红框是自激活验证的实验图像,比如图中,单一转化含OsHOP2或OsMFS1基因的质粒,酵母菌不能正常生长,因此证明这两个基因在酵母菌中不存在自激活现象。通常情况下,自激活验证中酵母菌不能生长,也是后续验证互作的实验数据是否可靠的前提。

    四缺图像中的绿框,同时共转含诱饵蛋白基因OsHOP2和猎物蛋白基因OsMFS1的质粒,酵母菌能在四缺平板上正常生长,证明OsHOP2与OsMFS1在酵母菌中能够互作,诱导报告基因转录。通常情况下,三/四缺平板上,共转两基因质粒的酵母能够生长证明两基因存在互作。反之,如果不能生长,则两基因不存在互作,或互作强度弱。

     

    酵母双杂文库构建实验流程

    酵母双杂文库筛选实验流程

     

     
     

    Q&A

    Q:酵母双杂筛库中出现了自激活现象怎么办?

    A:可通过尝试增加ABA或3-AT浓度来抑制自激活,若加入高浓度ABA或3-AT依然不能抑制自激活现象,就需要尝试重新构建载体,截短蛋白,或更换其他技术进行互作验证。

    Q:酵母双杂筛库时三缺平板上酵母菌能正常生长(显色培养基上能变蓝),而四缺平板上酵母菌不能正常生长(显色培养基上不变蓝),能证明互作吗?

    A:在自激活验证,阳性对照,影响对照都在正常的情况下,通常,三缺生长可以证明存在互作现象,四缺不生长(或不变蓝)证明互作强度可能较弱。

    Q:双杂出现假阳性怎么解决?

    A:增加ABA和3-AT浓度,抑制假阳性;或增加啊报告基因类型,提高筛选强度

     

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