项目文章Nature Communications（IF=16.1) | 浙江大学潘李隆团队揭示媒介昆虫传播植物病毒新机制
发布时间：
2024-12-05 16:16
来源：
在农业生产中，病毒病防治是确保农作物健康生长、提高产量和品质的关键环节。病毒病的发生不仅会降低农作物的产量，还可能严重影响农产品的质量，从而对农民的经济收益造成损害。
由于双生病毒等虫媒病毒在过去数十年大面积暴发成灾，科学界对媒介昆虫传播植物病毒的过程进行了大量研究。媒介昆虫通过在带毒植物上取食获取病毒，随后迁移至未带毒植物上通过取食完成病毒的分泌，随后病毒开始侵染。媒介昆虫取食可诱导植物生理生化的剧烈变化，探究这些植物生理生化的变化如何影响后续虫媒病毒的侵染以及虫媒病毒在这个过程中如何维持自身的侵染至关重要。
近日浙江大学张婧茹为第一作者，潘李隆为通讯作者，在学术期刊Nature Communications（IF=16.1）上发表了题为Viral proteins resolve the virus-vector conundrum during hemipteran-mediated transmission by subverting salicylic acid signaling pathway的文章，该研究揭示了虫媒病毒通过干扰媒介昆虫取食诱导的抗病毒免疫反应从而促进自身传播的分子机制。
研究内容
01 烟草曲茎病毒及其卫星共感染减轻烟粉虱诱导的 SA 积累以抑制宿主植物对烟草曲叶病毒的抗性
研究烟粉虱（Bemisia tabaci）、宿主植物烟草（Nicotiana tabacum）、烟草曲茎病毒（TbCSV）及其相关卫星（TbCSB）的四重相互作用，发现烟粉虱的侵染显著增加了烟草中的内源性水杨酸（SA）和茉莉酸-异亮氨酸（JA-Ile）水平，但不影响茉莉酸（JA）水平。
进一步研究表明，烟粉虱的侵染诱导了SA积累，进而增强了植物对TbCSV的抵抗力，但当植物同时被TbCSV和TbCSB侵染时，这种抵抗力减弱。外源SA喷洒结果也显示，喷洒1.0 mM和2.0 mM的SA能显著增强植物对TbCSV的抵抗力，但对TbCSV+TbCSB共感染时则没有这种效果。类似的结果也在番茄对中国番茄曲叶病毒（ToLCCNV）及其相关卫星（ToLCCNB）的研究中也发现了。这些现象表明烟粉虱侵染 促进了SA积累进而增加植物对TbCSV的抵抗力，但当与TbCSB共感染时，这种由SA调节的抗病毒抵抗力被消除。
图1 烟粉虱侵染诱导的 SA 积累增加了植物对 TbCSV 的抗性，但不增加对 TbCSV + TbCSB 复合体的抗性
02 卫星DNA β编码的 βC1通过干扰 SA 信号减轻 SA 治疗对双生病毒感染的负面影响
猜测这一现象可能是由于卫星DNA β参与了SA 的分解代谢或干扰SA信号传导的关键步骤。研究发现感染TbCSV病毒并未显著改变SA含量，而同时感染TbCSV和TbCSB病毒会略微提高SA水平。
通过分析SA相关基因PR1a和PR2的转录水平，发现SA信号通路为激活状态，表明卫星DNA β可能直接或间接干扰SA信号传导。卫星DNA β编码的βC1蛋白，这是许多双生病毒-卫星DNA β复合体中一个重要的致病性决定因素。
比较了在SA处理下与野生型和不能表达βC1的突变型（mTbCSB）分别与TbCSV共感染结果。突变型mTbCSB中，外源SA显着增加了植物对TbCSV的抗性，TbCSV水平降低证明了这一点。
构建异位表达TbCSB βC1的转基因本氏烟，在转基因植物中，βC1的表达导致SA喷洒后未能增强对TbCSV的抵抗力，并且βC1显著下调了SA信号通路中PR1a和PR2的转录水平。这表明，卫星DNA β编码的蛋白βC1抑制了SA调节宿主植物对病毒入侵的免疫力，并干扰了SA信号通路。
图2 βC1减轻 SA 治疗对双生病毒感染的有害作用，并干扰 SA 信号传导
03 本氏烟的HSP90是 TbCSB βC1的真正靶点
为了探究βC1蛋白如何干扰SA信号通路的激活，鉴定了与TbCSB βC1相互作用的蛋白质。通过在大肠杆菌中表达和纯化GST和GST-βC1蛋白，并将其与本氏烟的总蛋白提取物孵育，通过质谱分析鉴定了一个100-kDa的蛋白质条带，该条带被鉴定为六种本氏烟的热休克蛋白90（HSP90）。
进一步通过双分子荧光互补（BiFC）和酵母双杂交实验以及免疫共沉淀（Co-IP），证实了TbCSB βC1与NbHSP90蛋白之间的相互作用。通过BiFC测试NbHSP90-2和NbHSP90-10的不同结构域与TbCSB βC1的相互作用，发现所有三个结构域都与TbCSB βC1相互作用，表明本氏烟的的HSP90为TbCSB βC1的靶标。
图3 TbCSB βC1与本氏烟草 HSP90(NbHSP90)相互作用的研究
04 NbHSP90s负调控 SA 信号通路和植物对 TbCSV + TbCSB 复合物的抗性
使用格尔德霉素（GDA）这一特异性抑制HSP90s的化合物，研究了NbHSP90s在调节SA信号通路和抗病毒反应中的作用。实验发现，GDA处理导致叶片喷洒SA的样品中SA信号通路相关基因PR1a和PR2的转录水平上升，而对照组没有变化。
此外，通过基因沉默（VIGS）技术降低NbHSP90-2、NbHSP90-10和NbHSP90-12的表达，也观察到PR1a和PR2转录本水平的显著升高，表明HSP90s在抑制SA信号通路中起着关键作用。NbHSP90s的沉默增强了植物对双生病毒-卫星DNA β复合体的抵抗力，表现为病毒载量的减少。
这些结果表明NbHSP90s是SA信号通路的负调节因子，并且在植物抵双生病毒-卫星DNA β复合体的防御反应中起着重要作用。
图4 NbHSP90s 负调控 SA 信号传导和植物对 TbCSV + TbCSB 复合物的抗性
05 NbHSP90与 SA 信号负调控因子 NbNPR3相互作用
发现HSP90s在植物体内以寡聚体的形式存在，并通过BiFC实验证实了三种NbHSP90之间的相互作用，以及它们与NbNPR3的特异性相互作用。
NbNPR3是拟南芥SA受体NPR蛋白的同源物，是SA信号通路的抑制因子和植物对双生病毒抗性的抑制因子。通过VIGS技术沉默NbNPR3导致SA信号通路相关基因PR1a和PR2的表达水平上升，并增强了植物对双生病毒-卫星DNA β复合体的抵抗力。
相反，异位表达NbNPR3的转基因植物在SA信号传导或植物抗性方面与对照植物相比没有显著差异。这些结果表明NbHSP90s与NbNPR3相互作用，并且NbNPR3在调节SA信号通路和植物抗性方面起着关键作用。
利用VIGS技术在本氏烟中沉默了NbHSP90s和NbNPR3，以探究它们在TbCSB βC1抑制SA信号通路中的作用。实验结果表明，在外源喷洒SA下，βC1转基因植物的PR1a和PR2转录水平受到抑制，但当NbHSP90-2被沉默时，这种抑制被消除。同样，当NbNPR3被沉默时，无论是野生型还是βC1转基因植物，PR1a和PR2的转录本水平都变得相似的。
这些发现表明NbHSP90s和NbNPR3共同参与了TbCSB βC1对SA信号通路的抑制过程。
图5 NbHSP90与 SA 信号传导的负调节因子 NbNPR3相互作用，并且 NbHSP90和 NbNPR3都是 TbCSB βC1抑制 SA 信号传导所必需的
06 TbCSB βC1以 NbHSP90s 依赖的方式抑制 SA 诱导的 NbNPR3降解
通过酵母双杂交实验发现TbCSB βC1与NbNPR3之间没有直接相互作用，这表明TbCSB βC1可能通过NbHSP90s调节NbNPR3。为了验证这一假设，研究人员使用半活体降解实验和蛋白酶体抑制剂MG132来测试SA对NbNPR3稳定性的影响。实验结果表明，SA促进了NbNPR3的降解，而MG132的加入抑制了这种降解。
此外，研究人员还发现TbCSB βC1-Flag的存在干扰了SA诱导的NbNPR3降解，表明TbCSB βC1通过与NbHSP90s相互作用来抑制NbNPR3的降解。
这些结果表明，SA诱导的NbNPR3降解是蛋白酶体依赖性的，TbCSB βC1通过与NbHSP90s相互作用抑制了NbNPR3的降解。
图6 SA 诱导的 NbNPR3降解被 TbCSB βC1以 NbHSP90s 依赖的方式中断
07 由蚜虫携带的植物病毒编码的病毒蛋白以 NbHSP90和 NbNPR3为靶标抑制 SA 信号传导
通过烟粉虱传播的双生病毒-卫星DNA β复合体能够干扰SA信号传导，从而促进病毒的传播。为了探究其他通过媒介昆虫传播的病毒是否也采用类似的策略，研究人员研究了两种蚜虫传播的病毒——黄瓜花叶病毒（CMV）和芜菁花叶病毒（TuMV）对SA信号通路的调节作用。
这两种病毒分别编码2b和HC-Pro蛋白，据报告它们都能干扰SA信号传导。实验结果显示，CMV 2b和TuMV HC-Pro转基因的本氏烟草表现出典型的病毒诱导症状，并且与野生型植物相比，这些转基因植物中SA响应基因PR1a和PR2的表达水平显著降低。进一步的实验表明，CMV 2b和TuMV HC-Pro与NbHSP90-2和NbHSP90-10相互作用，并能抑制SA诱导的NbNPR3蛋白降解。
这些结果表明，蚜虫传播的病毒通过靶向NbHSP90s和NbNPR3蛋白来干扰SA信号通路，从而抑制植物的抗病毒免疫反应。这一发现揭示了不同病毒之间在利用宿主植物信号通路方面的保守机制，并为开发新的抗病毒策略提供了潜在的靶点。
图7 由蚜虫携带的植物病毒编码的病毒蛋白以 NbHSP90和 NbNPR3为靶标抑制 SA 信号传导
08 小结
研究发现，烟粉虱取食植物诱导水杨酸积累，从而显著提高植物对多种双生病毒的抗性。然而，在双生病毒与其伴随卫星一起接种时这种烟粉虱取食诱导的抗性被显著干扰，即病毒卫星可在烟粉虱取食情况下维持植物中双生病毒的侵染。
进一步的研究发现，病毒卫星通过干扰水杨酸信号通路发挥作用，且病毒卫星编码蛋白βC1在其中发挥主要作用。机制方面水杨酸通过蛋白酶体促进NPR3-HSP90s复合物的降解。负调控因子NPR3的降解激活了防御基因表达，增强了宿主植物对病毒入侵者的免疫力，进而抑制病毒复制。由载体携带的植物病毒（2b或HC-Pro）或其相关病毒卫星编码的蛋白βC1拮抗水杨酸诱导的抗病毒免疫（图8 右）。这些蛋白质与HSP90s结合，并通过尚不清楚的机制干扰了水杨酸诱导的NPR3降解，导致NPR3的持续存在，进而抑制水杨酸调节基因的表达和宿主植物对病毒入侵的免疫力，从而促进病毒复制。
该研究系统地揭示了在媒介昆虫介导的病毒传播过程中，媒介昆虫-植物病毒-植物三者间的相互作用对病毒扩散的促进作用和分子机制。
图8 昆虫载体-病毒-宿主相互作用中 SA 信号通路诱导和抑制动力学的工作模型
项目介绍
该研究署名南京瑞源生物技术有限公司为其提供水杨酸及糖基化水杨酸含量测定
瑞源生物&维百瑞检测建立了一种基于LC-MS/MS平台的植物激素分析方法，高通量检测包括生长素、赤霉素、细胞分裂素、脱落酸、茉莉酸、水杨酸在内的6大类植物激素。
定量分析采用同位素稀释法，可获得植物激素绝对含量。通过高效样品预处理技术对植物激素进行富集、纯化，结合高效液相色谱(HPLC)出色的分离能力和串联质谱(MS/MS)的高选择性，可有效降低复杂的样品基质对检测的干扰，进而提高植物激素的检测灵敏度，确保分析结果的可靠性。
