揭示蛋白 - 化合物互作机制：AI 多模态筛选融合分子对接、CETSA 以及 SPR 为靶点研究赋能
发布时间：
2025-12-10 11:19
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什么是蛋白-小分子化合物互作？ 简单说，就是小分子化合物（比如激素、药物、代谢物）通过特定结构位点与蛋白质结合，像钥匙插对锁一样，激活或抑制蛋白功能。这种互作是生命活动调控的核心分子基础，也是药物研发、功能基因组学等领域的关键研究方向。
一、互作机理
蛋白-小分子化合物互作本质是基于分子间非共价键（氢键、疏水作用、范德华力、静电相互作用）的特异性结合，即小分子作为配体（Ligand）与蛋白靶点（Target）的活性位点结合，诱导靶点构象改变，进而调控其酶活性、信号传导或分子转运等功能。
在蛋白 - 小分子化合物互作研究中，关键筛选策略涵盖 AI 多模态文库筛选、表面等离子体共振（SPR）、药物亲和反应靶向稳定性（DARTS）及小分子 - 蛋白质 Pull-down 技术；后续互作验证则可通过表面等离子体共振（SPR）、微量热脉动技术（MST）、等温滴定量热（ITC）与细胞热迁移（CETSA）等技术实现。
南京瑞源生物聚焦该领域需求，提供从筛选到验证的蛋白 - 小分子化合物互作整体解决方案。
二、互作筛选关键策略
1）AI多模态文库筛选服务
随着结构生物学与计算化学方法的成熟，基于结构的虚拟筛选（Virtual Screening, VS）已成为小分子先导发现与分子优化的重要手段。通过分子对接在计算机上高通量评估配体与蛋白的结合模式以及相对亲和力能显著降低实验成本、提高筛选效率。
小源采用Smina对外部提供或自建的化合物（蛋白）库进行两阶段虚拟筛选，系统评估候选分子的结合模式与打分，为后续的分子优化与功能验证提供依据。
AI多模态文库筛选原理示意图
2）表面等离子体共振（SPR)
除了上面提到的虚拟预测干实验，湿实验也可以用来筛选蛋白-小分子化合物的互作。小源开发了基于Biacore平台的亲和力测定SPR技术，当偏振光以临界角入射到金属薄膜（常用金、银）与介质的界面时，光子能量会激发金属表面自由电子，形成表面等离子体波。共振发生时，入射光的大量能量被转移，导致反射光强度显著减弱，对应的角度或波长即为共振角 / 共振波长，通过检测这种变化可以分析分子间的相互作用。
SPR原理图
3）药物亲和反应靶向稳定性（DARTS）
SPR 技术依赖高质量纯化样品，AI 筛选再精准也仅停留在预测层面；而 DARTS 技术恰好补上这一短板 —— 它能直接验证小分子与细胞内天然蛋白的结合活性，且复杂样本中蛋白可保持天然互作状态，更贴近生理实际场景。
DARTS主要是一种非标记型的小分子药物靶点筛选与验证技术，原理是当小分子药物与靶标蛋白特异性结合后，能够改变蛋白自由能，使靶标蛋白对广谱蛋白酶的水解作用产生更强抗性，而未结合小分子药物的蛋白易被蛋白酶水解，通过对比两组蛋白的水解差异，就能筛选并鉴定出与小分子结合的靶标蛋白。
药物亲和反应靶向稳定性（DARTS）原理图
4）小分子-蛋白质Pull-down技术
小分子-蛋白质Pull-down技术主要是先通过化学修饰给活性小分子连接生物素等亲和标签，制成小分子探针；再把探针固定在链霉亲和素磁珠等固相支持物上作为 “诱饵”；此时能与小分子特异性结合的靶蛋白会被探针捕获；之后经过严格清洗去除非特异性结合的杂蛋白，最后洗脱捕获到的靶蛋白，通过 Western Blot 或质谱等技术鉴定蛋白“身份”。
小分子-蛋白质Pull-down原理图
三、精准验证互作真实性与功能性
1）表面等离子体共振（SPR）
SPR技术除了可以用作筛选外，也可用于验证。当偏振光以临界角入射到金属薄膜（常用金、银）与介质的界面时，光子能量会激发金属表面自由电子，形成表面等离子体波。共振发生时，入射光的大量能量被转移，导致反射光强度显著减弱，对应的角度或波长即为共振角 / 共振波长，通过检测这种变化可以分析分子间的相互作用。
2）微量热泳动技术（MST）
微量热泳动（MicroScale Thermophoresis，MST）是一种基于热泳动现象的高灵敏度生物分析技术，核心是用于定量检测溶液中分子间的相互作用。
其原理是通过红外激光在毛细管样品中构建局部温度梯度，荧光标记的目标分子（如蛋白、核酸）会在温度梯度中产生定向迁移（热泳动）；当该分子与配体（如小分子、另一蛋白）结合形成复合物时，会导致热泳动速率变化，从而分析分子间相互作用以及各种化学剂量学参数。
微量热泳动技术（MST）原理图
3）等温滴定量热（ITC）
等温滴定量热（Isothermal Titration Calorimetry，ITC）是一种在恒温条件下，通过精准检测分子结合过程中热量变化，实现生物分子互作定量分析的核心技术。
它可以直接测量生物分子结合过程中释放或吸收的热量，适用于研究蛋白、核酸、多肽、药物分子等的相互作用。
等温滴定量热（ITC）原理图
4）细胞热迁移技术（CETSA）
在分子互作验证技术中，细胞热迁移技术（CETSA）打破了传统体外技术（如 SPR、ITC）的局限，无需纯化蛋白、无需修饰分子，直接以完整细胞或组织为样本。当加热处理细胞时，随着温度的升高，蛋白质逐渐变性沉淀，有活性的可溶性蛋白量逐渐减少。当细胞经药物处理后，药物和靶蛋白结合，使靶蛋白的热稳定性增强，熔解温度（Tm）值增加，根据药物处理前后Tm的变化情况，确定靶蛋白和药物在生理水平上是否有相互作用。
细胞热迁移技术（CETSA）原理图
四、文献举例
1）案例一
以2025年发表的“Wogonin, a bioactive flavonoid from Scutellaria baicalensis, alleviates alcoholic pancreatitis via AMPK-mediated TFEB activation”为例。
该研究为鉴定黄芩（HQ）的靶点，对四种黄芩衍生的黄酮类化合物进行了虚拟筛选和分子对接。分子对接和Western印迹分析表明，汉黄芩素（Wogonin）与AMPK（AMP活化蛋白激酶）强结合并促进AMPK磷酸化以增强TFEB（EB转录因子）的转录活性（图1）。
为验证Wogonin-AMPK的直接相互作用，等温滴定量热法（ITC）、表面等离子体共振（SPR）、细胞热迁移（CETSA）等实验证明汉黄芩素结合并增强的AMPK热稳定性。汉黄芩素恢复了AMPK和TFEB蛋白水平，组织学分析显示酶原颗粒（Zymogen Granules, ZG）积累的显著减轻（图2）。总的来说，汉黄芩素直接结合AMPK减轻酒精诱导的胰腺损伤和酶原颗粒（ZG）蓄积。
研究确立汉黄芩素作为黄芩治疗功效背后的关键生物活性驱动因素，协调AMPK-TFEB-自噬协调以减轻酒精性胰腺炎（AP），为开发植物源药物靶向TFEB以治疗胰腺炎提供了新的治疗策略。
图1 对 HQ 组分与 TFEB 上游激酶进行分子对接分析。
A. 葛根素、黄芩素、黄芩苷、葛根素苷的化学结构；B. 葛根素、黄芩素、黄芩苷、葛根素苷分别与AMPKa2（6BX6）、ERK2（4G6O）和 mTOR（4JT5）的最优结合能量；C. 葛根素分别与 AMPKa2（6BX6）、ERK2（4G6O）和 mTOR（4JT5）的最优结合模式；D. 对接受HQ处理的细胞的总细胞裂解物进行免疫印迹分析；E. 对p-AMPK和p-AMPK + t-AMPK组合进行光密度分析；F. 对接受葛根素处理的细胞的总细胞裂解物进行免疫印迹分析；G. 对p-AMPK和p-AMPK + t-AMPK组合进行光密度分析。
图2 汉黄芩素（Wogonin）直接与 AMPK 相互作用，从而减轻酒精性胰腺炎的病理症状。
A - B. Wogonin 与 AMPK 之间相互作用的等温滴定热分析；C. 表面等离子体共振（SPR）分析证实了Wogonin与 AMPK 之间具有高亲和力的结合；D. Wogonin - AMPK 相互作用的细胞热迁移分析工作流程图；E - F. 基于 CETSA 的Wogonin与 AMPK 相互作用的测定；G. 对Wogonin处理过的小鼠的总胰腺裂解物进行了免疫印迹分析；H. 对 AMPK 和 TFEB 进行了密度分析；I. 用酒精和Wogonin处理的小鼠胰腺的代表性 H&E 和甲苯胺蓝染色图像；J. ZG 的面积被计数；K. 测量血清淀粉酶。
2）案例二
以2025年发表的“Cyclovirobuxine D ameliorates cardiomyocyte senescence in diabetic cardiomyopathy mice by enhancing mitochondrial function via sirtuin 3–ATP5O signal axis”为例。研究通过免疫共沉淀、细胞热迁移（CETSA）以确定环维黄杨星D（CVB-D）与SIRT 3相互作用且CVB-D显著增加了SIRT 3在不同温度下的热稳定性。微量热泳动（MST）、表面等离子体共振（SPR）、等温滴定量热（ITC）实验结果表明SIRT 3直接与ATP 5O结合（图3）。
最终得出结论，CVB-D激活SIRT 3，从而促进其去乙酰化功能，进而增加去乙酰化ATP 5 O的水平，从而延缓心肌细胞的衰老，明确了CVB-D抑制心肌细胞衰老的分子机制，这可能有助于促进研究缓解糖尿病心肌病（DCM）的进展。
图3 CVB-D的保护作用取决于SIRT3对ATP5O的去乙酰化。
A-B. SIRT3和ATP5O在心肌组织中的共定位免疫荧光图像；C. 免疫沉淀分析表明，用CVB-D预处理可抑制NMVMs中ATP5O的乙酰化（n=3）；D-E. NMVMs中SIRT3 和ATP5O共定位的免疫荧光图像（比例尺=20 微米）；F. 对用CVB-D或DMSO处理48小时的NMVMs进行CETSA（n=3）；G. CVB-D与SIRT3蛋白的分子对接；H. CVB-D与SIRT3相互作用的MST分析；I. SIRT3与ATP5O蛋白之间的分子对接；J. 通过SPR测定SIRT3和ATP5O的结合亲和力；K. 等温滴定量热法（ITC）测定表明SIRT3对ATP5O具有结合亲和力。
五、应用
1）新药研发与优化（核心应用领域）
靶点验证：确认小分子与疾病相关靶蛋白（如肿瘤驱动蛋白、病毒酶）的特异性结合，验证该蛋白是否为药物作用的有效靶点。
高通量药物筛选：利用互作检测技术快速筛选化合物库，找出能与靶蛋白高亲和力结合的潜在药物分子（如从天然产物库中筛选抗癌小分子）。
药物耐药性研究：探究耐药性突变蛋白与药物分子的互作变化（如突变后结合力下降），为设计新一代耐药性药物提供依据。
2）基础生物学研究
蛋白功能解析：通过小分子化合物调控蛋白活性（激活或抑制），观察细胞或生物体的表型变化，明确生理功能。
酶学机制分析：研究小分子（底物、抑制剂、激活剂）与酶的结合特性，明确酶的催化机制、底物特异性及调控方式。
3）农业与食品领域
农药研发：筛选能与害虫、病原菌关键蛋白（如昆虫乙酰胆碱酯酶、真菌细胞壁合成酶）结合的小分子，开发高效、低毒的农药。
食品添加剂研发：优化食品中功能小分子与人体肠道蛋白、消化酶的互作，提升营养吸收效率或改善风味。
4）诊断试剂开发
疾病标志物检测：设计能与疾病特异性蛋白（如肿瘤标志物、病毒蛋白）高特异性结合的小分子探针，开发快速诊断试剂。
药物浓度监测：利用小分子与药物结合蛋白的互作，开发检测方法，实时监测患者体内药物浓度，指导精准用药。
六、参考文献
[1]Brett L ,Gwanghyun J ,A J W , et al.Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS).[J].Current protocols in chemical biology,2011,3(4):163-180.
[2]Xi D ,Shan L ,Yu T , et al.Bavachinin Protects the Liver in NAFLD by Promoting Regeneration via Targeting PCNA.[J].Journal of advanced research,2023,55131-144. DOI:10.1016/J.JARE.2023.02.007.
[3]Andrea S .Isothermal Titration Calorimetry: A Biophysical Method to Characterize the Interaction between Label-free Biomolecules in Solution[J].Bio-protocol,2018,8(15):e2957-e2957.DOI:10.21769/BioProtoc.2957.
[4] J C W ,Philipp B ,Ulrich R , et al.Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis.[J].Nature communications,2010,1(1):100.DOI:10.1038/ncomms1093.
[5]Qin Z ,Sun X ,Zeng J , et al.Wogonin, a bioactive flavonoid from Scutellaria baicalensis, alleviates alcoholic pancreatitis via AMPK-mediated TFEB activation.[J].Journal of advanced research,2025,DOI:10.1016/J.JARE.2025.11.006.
[6]Qin Z ,Sun X ,Zeng J , et al.Wogonin, a bioactive flavonoid from Scutellaria baicalensis, alleviates alcoholic pancreatitis via AMPK-mediated TFEB activation.[J].Journal of advanced research,2025,DOI:10.1016/J.JARE.2025.11.006.
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