IP-MS：筛选互作蛋白-解析分子机制
发布时间：
2025-11-10 15:13
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在蛋白质研究的微观世界中，蛋白质往往通过与其他蛋白相互作用形成复合物，共同调控信号传递、增殖、代谢等关键的生命活动。免疫沉淀-质谱分析技术（IP-MS）能够精准地捕捉到这些“合作关系”，其巧妙融合了免疫沉淀的特异性和质谱的高灵敏度，能让隐藏的蛋白互作关系“无处遁形”。其核心可概括为“精准捕获+高通量鉴定”，能够解决传统蛋白互作研究中的“特异性不足”和“效率低”两大问题。今天就带大家全面解锁IP-MS技术的核心奥秘。从植物到动物医学，多项研究证明：IP-MS是突破的核心工具。接下来让我们看看不同一场景下IP-MS的应用及得到的结果，全面了解IP-MS的原理及技术优势。
案例一：植物抗逆研究——解码生长与抗逆的“调控密码”
2021年发表在《The EMBO journal》上的“Clock component OsPRR73 positively regulates rice salt tolerance by modulating OsHKT2;1-mediated sodium homeostasis”中作者通过对OsPRR73突变体进行RNA-seq分析鉴定到不同NaCl处理时间下的多个DEG（差异表达基因）。GO（Gene Ontology）分析发现钠离子转运蛋白在NaCl处理的DEG中特异性富集，表明钠离子转运蛋白可能参与OsPRR73突变体的盐胁迫响应。分析表明，在用4h NaCl处理的OsPRR73突变体中，钠转运相关蛋白OsHKT 2;1被诱导表达。这些结果表明，Na+和活性氧的稳态失衡可能促成了OsPRR73突变体对盐度的超敏反应。
研究进一步通过荧光定量PCR、转录活性测定、ChIP-qPCR、EMSA实验证明 OsPRR73 与OsHKT2;1 启动子直接互作，抑制其表达（图1）。
图1 OsPRR 73结合OsHKT 2;1启动子以抑制其转录
A、B. OsHKT 2;1和OsHKT 1;5在有或没有盐胁迫的OsPRR 73突变体和野生对照植物中在多个时间点的表达水平；C. 在本氏烟草的浸润叶中的瞬时表达测定显示OsPRR 73可以抑制OsHKT 2;1转录。左图显示OsHKT 2;1和OsPRR 73的生物发光信号；D. OsHKT 2; 1 pro：LUC生物发光强度的定量如（C）所示；E. ChIP-qPCR分析显示，与野生型DJ对照相比，OsPRR 73富集了包括OsHKT 2;1启动子的S3和S4区的DNA片段；F. 用OsPRR 73与针对OsHKT 2;1启动子的S4区设计的探针孵育的EMSA分析。
为探讨 OsPRR73 对OsHKT2;1 抑制的具体机制，研究通过免疫沉淀-质谱分析（IP-MS）鉴定到与OsPRR 73可能存在互作的19个核蛋白（表1），其中针对与转录抑制相关的HDAC 10蛋白进行了后续研究。通过Co-IP、双分子荧光互补（BiFC）分析表明HDAC 10与OsPRR 73存在相互作用。研究通过截短后Co-IP还发现OsPRR73的N端PR结构域是与HDAC10相互作用所必需的。ChIP-qPCR检测发现OsPRR73突变体中OsHKT 2;1两个启动子区域上的H3K9ac水平（组蛋白乙酰化修饰）显著增加，双荧光素酶报告基因实验表明OsPRR73和HDAC10能够抑制OsHKT2;1的转录，因此OsPRR73可能通过与组蛋白脱乙酰基酶HDAC10互作来抑制OsHKT2;1转录（图2）。
表1 IP-MS共鉴定OsPRR 73复合物中两个生物学重复共有的19个核蛋白
图2 OsPRR73在细胞核中与HDAC10物理相互作用。
A. Co-IP显示OsPRR 73和HDAClO之间在体内的物理相互作用；B. LCA测定显示OsPRR 73与HDAC 10在烟草叶中互作；C. BiFC分析显示OsPRR 73与HDAC 10的相互作用发生在细胞核中；D. 缺失PR和CCT结构域的OsPRR 73与HDAC 10的互作很弱；E，F. 染色质免疫沉淀-qPCR（ChIP-qPCR）检测，使用H3 K9 ac（E）和H3（F）抗体检测OsHKT 2;1富集的启动子区域；G,H. LCA表明OsPRR73和HDAC10能够抑制OsHKT2;1的转录。
小结：作者聚焦水稻昼夜节律核心组件 OsPRR73 与耐盐性的关联机制。为找到 OsPRR73 的互作蛋白，以OsPRR73为诱饵利用 IP-MS筛选其互作蛋白，成功筛到HDAC10。后续验证实验证实，二者形成的转录抑制复合物可直接调控钠转运蛋白基因 OsHKT2;1的表达，从而通过维持水稻体内钠稳态来增强耐盐性。IP-MS的高通量筛选能力，让“蛋白互作 - 抗逆”的调控机制得以呈现。
案例二：植物抗病机制——破解“宿主-病原体”的博弈战场
中国农业大学朱旺升团队2024年在《Molecular Plant》发表的“Natural variations of maize ZmLecRK1 determine its interaction with ZmBAK1 and resistance patterns to multiple pathogens”中作者通过全基因组关联分析定位到广谱抗病基因 G型凝集素受体激酶ZmLecRK1，发现其存在抗病（ZmLecRK1Qi319）与感病（ZmLecRK1TY4）两种单倍型，Sanger测序揭示二者仅在胞外结构域（ECD）内的氨基酸存在差异，经烟草中瞬时表达发现，ZmLecRK1Qi319的表达诱导明显的细胞死亡，而ZmLecRK1TY4不然。
为探究ZmLecRK1的机制，该研究通过IP-MS鉴定到ZmLecRK 1的互作蛋白是富含亮氨酸的重复激酶ZmBAK 1。而后在烟草体系中发现，NbBAK l是本氏烟草中ZmLecRK l诱导的细胞死亡所需的。在玉米中ZmBAK1突变系导致的细胞死亡明显被抑制，说明在玉米中ZmLecRK 1 Qi 319诱导的细胞死亡需要ZmBAK 1的参与。然后研究发现将ZmBAK1突变系植株对蚜蝇、玉米小斑病菌（B. maydis）和立枯丝核菌（R. solani）的抗病性均弱于野生型。综上，ZmBAK 1是玉米中ZmLecRK 1介导的抗性所必需的（图3）。
图3 ZmBAK1是ZmLecRK 1诱导的细胞死亡所必需的，并积极调节多病原体抗性。
A. 通过IP-MS分析鉴定ZmLecRK 1 Qi 319及其相互作用ZmBAK 1；B. 代表性的叶显示ZmLecRK 1 Qi 319诱导的细胞死亡需要NbBAK 1，而不是NbSOBIR 1；C. ZmLecRK 1 Qi 319在玉米KN 5585和zmbak 1原生质体中引发细胞死亡，用不同载体组合共转染不同玉米原生质体中的LUC活性；D. 在接种后21天，用蚜虫疫霉感染的zmbak 1品系和KN 5585的田间代表性疾病表型（左）和病变长度（右）；E. 田间代表性疾病表型（左）、SLB评分（中）和接种后21天感染玉米B的zmbak 1品系和KN 5585的玉米B的相关生物量（右）；F. 接种后14天，感染立枯丝核菌的zmbak 1株系和KN 5585的田间代表性病害表型（左）、病斑长度（中）和BLSB评分（右）。
为探究ZmLecRK1的等位基因变异是否影响与ZmBAK1的结合亲和力，研究通过BN-PAGE检测发现，拟南芥和玉米原生质体中ZmLecRK 1 Qi 319能够与ZmBAK1形成复合物，而在ZmLecRK 1 TY 4植物中未检测到复合物显著信号。
SLC、Co-IP结果表明与ZmLecRK 1 TY 4-ECD相比，ZmBAK 1-ECD对ZmLecRK 1 Qi 319- ECD表现出更高的亲和力，并且ZmBAK 1增强了ZmLecRK 1 Qi 319的自相互作用，但对ZmLecRK 1 TY 4没有影响。在烟草中经疫霉和几丁质处理后能够增强ZmLecRK1Qi319与ZmBAK1的互作。这些结果表明相比于ZmLecRK 1 TY 4，ZmBAK 1能够更稳健地与ZmLecRK 1 Qi 319相互作用，增加了更多蛋白质复合物的形成（图4）。
图4 ZmLecRK1Qi319与ZmBAK1的相互作用比ZmLecRK1TY4更强，并形成更多的蛋白质复合物。
A-B. BN-PAGE所示ZmLecRK 1过表达的拟南芥（A）和玉米原生质体（B）中的ZmLecRK 1相关复合物；C-D. 在本氏烟草中，通过SLC（C）和Co-IP（D）测定，全长ZmBAK 1和ZmLecRK1Qi319之间的相互作用强于与ZmLecRK1TY4之间的相互作用；E. 本氏烟草中SLC所示ZmLecRK 1 Qi 319-ECD和ZmLecRK 1 TY 4-ECD与ZmBAK 1-ECD的相互作用强度的比较；F-G. 本氏烟草叶（F）和玉米原生质体（G）中的Co-IP测定所示，与ZmLecRK 1 TY 4-ECD相比，ZmLecRK 1 Qi 319-ECD与ZmBAK 1-ECD的相互作用更强；H. 本氏烟中的Co-IP所示ZmBAK 1可以特异性地增强ZmLecRK 1 Qi 319的自相互作用强度。I-J. SLC所示蚜不同处理对ZmLecRK 1 Qi 319-ZmBAK 1相互作用的影响。
小结：IP-MS不仅首次鉴定出 ZmLecRK1 的关键互作蛋白 ZmBAK1，更通过对比不同单倍型的互作差异，为解析自然变异的功能提供了直接证据。由于IP-MS捕获的“互作强度差异”，从而得以探索构建出完整的调控模型：ZmLecRK1的A404位点通过增强与 ZmBAK1 的互作及复合体形成能力，激活下游免疫信号，从而赋予玉米广谱抗病性。这一发现为通过单碱基编辑改造抗病基因提供了精准靶点，展现了 IP-MS 在农业育种基础研究中的巨大价值。
IP-MS不仅解析植物信号通路，还能帮助我们探索动物疾病相关蛋白互作网络，挖掘关键互作节点，为后续机制研究及疗法开发提供方向。
案例三：动物医学——挖掘治疗耐药的“隐形推手”
中山大学肿瘤防治中心元云飞、李斌奎团队发表于《Nature Communications》《Targeting PRMT3 impairs methylation and oligomerization of HSP60 to boost antitumor immunity by activating cGAS/STING signaling》的研究中，IP-MS 技术从 “定位关键分子” 到 “解析修饰机制” 层层突破，首次揭开了肝癌免疫逃逸的表观遗传密码。
蛋白质精氨酸甲基转移酶3（protein arginine methyltransferase 3 ,PRMT 3）在肝细胞癌HCC 中对奥沙利铂的治疗耐药性中起关键作用，所以研究以PRMT 3为诱饵进行IP-MS分析，发现线粒体热休克蛋白HSP60是PRMT3的核心互作蛋白；免疫荧光染色、Co-IP显示，PRMT3和HSP60在自发肿瘤细胞质中相互作用。为探讨其作用机制，研究通过敲除PRMT 3或加入PRMT 3抑制剂SGC 707发现，SGC707会显著降低肿瘤中的HSP 60-ADMA（不对称二甲基精氨酸）。其中PRMT 3过表达会增加HSP 60-ADMA。综上数据表明PRMT 3直接调节HSP 60的精氨酸甲基化。
而后研究通过质谱数据分析发现，R446是唯一的精氨酸甲基化位点。为确定PRMT 3是否调节R446的甲基化，WB检测发现HSP60-ADMA在PRMT3突变体中被消除，PRMT3突变体或SGC 707对PRMT 3的抑制显著降低了HSP 60的寡聚化，并且HSP 60-R446 K突变体表现出比HSP 60-WT少得多的寡聚化形成。因此得到PRMT 3在R446处甲基化HSP 60并促进其寡聚化的结论（图5）。
图5 PRMT3在R446处甲基化HSP 60并促进其寡聚化。
A. 通过IP-MS分析获得Hepa 1 -6细胞中PRMT 3拉下的蛋白质的肽片段的评分和数目（95% CI）；B. WB分析显示，在PLC-8024和Hepa 1 -6细胞中，内源性PRMT 3和HSP 60通过相互免疫共沉淀相互作用；C. 免疫荧光染色显示PRMT 3（红色）和HSP 60（绿色）在HCC细胞和Myc/Trp 53 −/−自发肿瘤中的共定位；D. WB分析确定PRMT 3-KO和SGC 707处理对Hepa 1 -6细胞中HSP 60的精氨酸甲基化的影响；E. 免疫沉淀HSP 60的WB分析，SGC 707处理对Myc/Trp 53 −/−自发性肿瘤中HSP 60精氨酸甲基化的影响；F. WB分析确定PRMT 3-OE对HEK 293和HepG 2细胞中HSP 60的精氨酸甲基化的影响；G. 通过液相色谱/串联质谱法鉴定的甲基化肽的裂解谱；H. HSP 60的R446周围的序列在多个物种中是进化上保守的。I. Flag标记的HSP 60-WT和HSP 60-R446 K突变体序列的示意；J. WB分析显示，R446 K突变显著降低过表达HSP 60-R446 K突变体的HEK 293细胞中的ADMA信号；K. WB分析确定了SGC 707处理和PRMT 3-KO对PLC-8024细胞中HSP 60寡聚化的影响； L.446 K突变显著减少了过表达HSP 60-R446 K突变体的HEK 293细胞中HSP 60的寡聚化。
小结：IP-MS 起到了核心作用，不仅精准筛到并PRMT3的互作蛋白 HSP60，更为后续的修饰位点鉴定与功能验证提供了关键。正是IP-MS捕获的 “蛋白互作信号”，得以构建完整的调控链条——PRMT3-HSP60（甲基化修饰）- 线粒体稳态 - cGAS/STING - 免疫激活，为开发新疗法提供了分子依据。
IP-MS的核心逻辑
初筛：以目标蛋白为诱饵，结合生信分析锁定候选（如 GO/KEGG 富集、蛋白网络分析），通过IP-MS高通量捕获潜在互作蛋白。
验证确认：针对候选蛋白，利用 Co-IP、酵母双杂一对一、BiFC等技术验证互作，形成筛选到验证的严谨逻辑。
机制解析：研究不同条件下（如疾病状态、药物处理）互作网络的动态变化，揭示调控机制。
功能关联：形成 “分子互作→表型→意义” 的完整链。
技术优势
1.、不仅可以用于验证已知的相互作用的蛋白，还可以用于寻找能与目的蛋白相互作用的未知的蛋白质分子。
2、可以检测更接近生理状态下的相互作用蛋白。
3、可提供多种蛋白互作方法进行进一步验证。
IP-MS的黄金应用场景
1、解析疾病机制
特别是在肿瘤的研究中，可通过IP-MS筛选致癌蛋白的互作蛋白，揭示分子网络，阐明疾病机制。
2、寻找药物靶点
IP-MS筛选药物靶蛋白的互作蛋白，分析其信号通路，为药物设计提供方向。
3、蛋白复合物研究
解析大分子复合物的组成及动态变化，揭示其功能调控机制。
从筛选蛋白到探究互作网络，IP-MS都能为我们探索蛋白功能的有力支持。无论是实验室“小白”还是资深研究者，掌握IP-MS的原理、流程，都能让其成为我们破解难题的钥匙。
小源从事蛋白互作筛选及互作验证服务已久，拥有丰富的蛋白互作研究经验。我们不仅有蛋白互作筛选技术—IP-MS（植物烟草体系）、还可配合蛋白互作验证技术服务—Co-IP、酵母双杂一对一、BiFC、Pull down验证等配套使用，直接“一条龙”服务，助力你的蛋白质互作研究！
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参考文献
[1]Hua W ,Xiling W ,Yuqing H , et al.Clock component OsPRR73 positively regulates rice salt tolerance by modulating OsHKT2;1-mediated sodium homeostasis.[J].The EMBO journal,2020,40(3):e105086-e105086.DOI:10.15252/EMBJ.2020105086.
[2]Li Z ,Chen J ,Liu C , et al.Natural variations of maize ZmLecRK1 determine its interaction with ZmBAK1 and resistance patterns to multiple pathogens.[J].Molecular plant,2024,17(10):1606-1623.DOI:10.1016/J.MOLP.2024.09.006.
[3]Shi Y ,Wu Z ,Liu S , et al.Targeting PRMT3 impairs methylation and oligomerization of HSP60 to boost anti-tumor immunity by activating cGAS/STING signaling.[J].Nature communications,2024,15(1):7930.DOI:10.1038/S41467-024-52170-3.
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