荧光系列技术对比：BiFC、LCA与DLR技术全解析
发布时间：
2025-06-04 14:46
来源：
双分子荧光互补BiFC
工作原理
将荧光蛋白（如YFP、GFP、RFP）分割成两个不具有荧光活性的分子片段（N-端，C-端），将两个荧光蛋白片段分别融合两个目标蛋白A、B，如果A与B蛋白发生了相互作用，在空间上互相靠近，就会重新构建成完整的具有活动的荧光蛋白分子，在激发光的激发下，荧光蛋白发出荧光。反之，若A与B蛋白之间没有相互作用，则不能被激发出荧光。
图 BiFC实验原理图
实验流程
(1)亚细胞定位预测：预测蛋白互作亚细胞定位位置（预测结果仅作参考，有后续实验发现不正确的可能）
(2)构建融合蛋白：将候选蛋白A与候选蛋白B的CDS序列分别构建到pCAMBIA1300-nYFP、pCAMBIA1300-cYFP载体中
(3)烟草转化：将上述重组质粒转化大肠杆菌扩繁后转化农杆菌，选取生长状态良好的幼嫩烟草叶片，进行农杆菌注射，培养
(4)荧光观察：利用激光共聚焦显微镜进行荧光成像，若观察到黄色（或对应荧光蛋白颜色）荧光信号，说明蛋白A和蛋白B发生了相互作用
图 BiFC实验流程图
实验设计
设置1组实验组、1组阳性对照组、2组阴性对照组；其中对照组每组包含YFP、Bright field、Merge各一张，实验组拍摄3个视野，每个视野包含YFP、Bright field、Merge各一张。
图3 pCAMBIA1300-cYFP质粒图谱
图 pCAMBIA1300-nYFP质粒图谱
结果图解读
图 结果图解读
荧光素酶互补LCA
工作原理
荧光素酶互补/荧光素酶蛋白互作分析（简称LCA），将荧光素酶（LUC）分割成两个不具有荧光活性的分子片段（N-端、C-端），将这两个荧光素酶的片段分别融合两个目标蛋白A、B，如果蛋白A与蛋白B发生了相互作用，在空间上互相靠近，就会重新构建成完整的具有活性的荧光素酶，发挥荧光素酶活性从而催化荧光素产生荧光。
图 LCA工作原理图
实验流程
(1)构建融合蛋白：将候选蛋白A和候选蛋白B的CDS序列分别构建到pCAMBIA1300-nLUC、pCAMBIA1300-cLUC载体中
(2)烟草转化：将上述重组质粒转化大肠杆菌扩繁后转化农杆菌，选取生长状态良好的幼嫩烟草叶片，进行农杆菌注射，培养
(3)定性观察：利用活体成像仪观察发光强度并拍照记录表型
(4)定量检测：破碎后利用酶标仪检测荧光值，并绘制荧光强度柱状图
图 LCA实验流程图
实验设计
每片叶子做5组，包含1组实验组，1组阳性对照，3组阴性对照。设置3次生物学重复，交付3片叶子照片
图8 pCAMBIA1300-cLUC质粒图谱
图 pCAMBIA1300-nLUC质粒图谱
结果图解读
图 结果图解读
DLR双荧光素酶报告基因
双荧光素酶工作原理
双荧光素酶报告基因前期小源已在（【技术介绍】——双荧光素酶报告基因技术服务）做了详细介绍，小伙伴们可前往查看。
案例解读
关于瑞源
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双荧光素酶报告基因是以萤火虫荧光素酶（Firefly luciferase）为报告基因，以海肾荧光素酶（Renilla luciferase）为内参基因，通过同时检测两种荧光素酶，实现对目标基因表达或分子互作的定量分析。
蛋白表达系统可以根据宿主细胞的类型，分为大肠杆菌原核表达系统，毕赤酵母真核表达系统、昆虫杆状病毒表达系统以及哺乳动物真核表达系统，选择正确的蛋白表达系统是实验成功的关键因素。
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