一文详解转录因子研究策略（下）
发布时间：
2025-02-21 17:24
来源：
转录因子与靶基因互作
在一文详解转录因子研究策略（上）中，小源着重从转录因子的筛选及鉴定、转录因子功能验证这两个方面进行了详细阐述。本次，小源将继续带大家深入了解剩下的两部分内容（转录因子与靶基因互作、转录因子与其他转录因子或蛋白互作）。
转录因子与靶基因启动子的顺式作用元件结合才能发挥作用，调控靶基因表达，靶基因与转录因子互作也是转录因子研究的一个重要方面。那么，转录因子自身基因的表达同样可能受到其他调控因子的作用，那么这些因子对于转录因子自身表达的调控也是一个重要的研究方向。
当我们知道了一个转录因子，如何去探寻与之互作的启动子？当我们知道了一个转录因子，如何去找到它的上游调控蛋白？蛋白和DNA互作的研究手段包括ChIP-seq、CUT-Tag、DAP-seq、以及反向酵母单杂），当然目前也有包括CUT&RUN、DamID等技术同样可以用于研究转录因子结合位点，在这里我们先介绍较为常见的几种。
1、ChIP-seq、CUT-Tag、DAP-seq
ChIP-seq、CUT-Tag、DAP-seq都是利用高通量测序技术去获得转录因子与DNA互作的信息。
ChIP-seq
ChIP-seq其实就是染色质免疫共沉淀，结合二代测序的过程。最初被用于组蛋白修饰的研究，后被广泛应用于转录因子与启动子结合的研究。
染色质免疫沉淀（Chromatin immunoprecipitation，ChIP）是一种在体内分离与特定蛋白结合的DNA片段的有效方法。该技术可以将与目标蛋白结合的DNA与蛋白共沉淀，并结合高通量测序获得互作DNA序列信息。
2024年发表的研究论文“CCT39 Transcription Factor Promotes Chlorophyll Biosynthesis and Photosynthesis in Poplar”为探究杨树中转录因子PpnCCT39对叶绿素合成和光合作用调节的分子机制，利用ChIP-seq对PpnCCT39过表达杨树进行分析，确定了共17194个PpnCCT39的潜在靶基因，并通过结合RNA-seq结果分析，确定 PpnCCT39 直接刺激参与叶绿素生物合成和光合作用途径的三个关键基因的转录：PagHO1 、 PagLIL3 和 PagPYG7。
图1 PpnCCT39 潜在调控靶基因及其功能富集的ChIP-seq分析
DAP-seq
DAP-seq是一种高效的体外鉴定转录因子结合位点的方法，通过将体外表达的转录因子和基因组DNA进行亲和纯化，然后洗脱与转录因子结合的DNA片段，进行高通量测序，从而获得目标转录因子的结合位点信息。
研究论文“SmHSFA8 Enhances the Heat Tolerance of Eggplant by Regulating the SmEGY3-SmCSD1 Module and Promoting SmF3H-mediated Flavonoid Biosynthesis”通过DAP-Seq 分析阐明了 SmHSFA8 调节茄子耐热性的分子机制，根据两个生物学重复共鉴定出 2272 个 SmHSFA8 结合峰。
在这些峰中，12.59% 位于靶基因的启动子区域内，对应于 286 个基因，其中鉴定了 6 个具有高置信度的基序，这些基序可能是热激转录因子 SmHSFA8 的结合位点。
图2 DAP-Seq 分析的 SmHSFA8 全基因组结合位点
CUT&Taq
CUT&Tag（Cleavage Under Targets and Tagmentation）技术是在ChIP-seq技术基础上发展而来，同样利用特异性抗体结合目标蛋白，但该技术融合了Tn5转座酶的作用对目标蛋白结合的DNA区域进行切割和标记，同时在序列两端加上测序接头，形成可用于高通量测序的文库。
2024年11月，中国农业大学宋任涛教授团队在Nature Plants发表了题为“ZmICE1a regulates the defence-storage trade-off in maize endosperm”的研究论文。ICE1（Inducer of CBF Expression 1）是调控植物应对非生物胁迫（如冷胁迫）的关键转录因子。在禾谷类作物中，ICE1进化出一个特化的同源蛋白ICE1a。
研究通过整合CUT&Tag-seq、RNA-seq以及突变体分析等技术手段发现，ZmICE1a能够促进中央胚乳的淀粉合成，进而提高籽粒的粒重。同时，ZmICE1a通过负向调控胚乳外周区域中的抗菌小肽等防御基因，抑制胚乳内真菌的繁殖。研究表明，ZmICE1a在中央胚乳的储藏功能与外周胚乳的防御功能之间起到了核心平衡作用。
2、反向酵母单杂
反向酵母单杂交通过构建七个碱基的随机motif（模体）文库，以pGADT7上的基因（编码转录因子）作为诱饵，然后筛选随机motif文库中与该诱饵转录因子互作的motif序列。
通过得到的motif序列确定该转录因子可能参与调控的靶基因。具体的内容大家可以参考小源之前发送过的推文产品升级 | TF-centered Y1H（反向酵母单杂交）服务全新升级。
蛋白-DNA互作验证
那么我们通过筛选得到了这些蛋白质的潜在结合DNA序列，如何去进一步验证转录因子和这些序列之间的互作关系呢？这时候一系列蛋白与DNA互作的验证实验如酵母单杂点对点验证、EMSA、双荧光素酶报告基因等实验均可以用于证明。
比如上述研究论文“SmHSFA8 Enhances the Heat Tolerance of Eggplant by Regulating the SmEGY3-SmCSD1 Module and Promoting SmF3H-mediated Flavonoid Biosynthesis”中在得到DAP-Seq筛选到的基序后，利用凝胶迁移实验（EMSA）、酵母单杂交（Y1H）、双荧光素酶报告（DLR）等实验结果验证，SmHSP21、SmHSP70、SmHSP70B是SmHSFA8的下游靶基因。
图3 SmHSFA8和SmHSP70、SmHSP70B和SmHSP21启动子的活化分析
转录因子与其他转录因子或蛋白互作
转录因子除了会与下游DNA结合，通过调节下游靶基因的表达来对生物体产生影响。转录因子也可能会通过与其他转录因子或蛋白产生互作来调节下游基因的表达，这时可以通过酵母双杂、IP-MS、Pull-down MS来筛选转录因子的其它互作蛋白。
1、酵母双杂
酵母双杂交系统是一种鉴定活细胞内蛋白质相互作用的研究方法，其原理是：Gal4转录因子由DNA结合域（binding domain，BD）和转录激活域（active domain，AD）组成，二者可以分开独立表达为有功能的蛋白。当二者在物理空间上靠近时可以表现出完整的转录因子活性。
基于此，把目的蛋白分别与BD、AD融合表达，当目的蛋白发生互作时，使得BD、AD在物理空间可以靠近，这时就能够表现出完整的转录因子功能，从而激活下游基因的表达。
2、IP-MS和Pull-down MS
IP-MS，即免疫沉淀-质谱联用技术，是一种基于质谱技术的分析方法。该技术通过特异性抗体捕获目的蛋白，形成“结合蛋白-靶蛋白-靶蛋白抗体-protein-A/G小珠”复合物。通过质谱检测捕获到的蛋白，得到蛋白互作信息。
Pull-down MS实验则是先通过Pull-down将目标蛋白质会先与特异性的结合蛋白质或小分子联结，然后通过一系列的洗涤步骤去除非特异性结合的蛋白质。剩下的与目标蛋白质有特异性结合的蛋白质复合物会被进一步分析，通过质谱技术鉴定出结合的蛋白质。
在2024年发表的研究论文“CDC48A, an interactor of WOX2, is required for embryonic patterning in Arabidopsis thaliana”中，已知WOX2是一个已知的调节胚胎发育相关的重要转录因子，研究通过IP-MS寻找WOX2潜在互作蛋白，其中CDC48A因为在之前的研究中被证明也与胚胎发育相关，因此被作为了重点关注的蛋白。
图4 IP-MS分析结果
蛋白互作验证
筛选完成后可以结合酵母双杂点对点验证、Co-IP、GST pull-down、BiFC实验来对互作蛋白进行验证。
2024年发表的研究论文“MYB168 and WRKY20 transcription factors synergistically regulate lignin monomer synthesis during potato tuber wound healing”中，作者利用双荧光素酶报告基因实验，首先发现StMYB168可以直接与StPAL5和StCAD14启动子结合以激活它们的表达，并且StWRKY20通过协同作用增强这种调节。然后通过Y2H、BiFC和Co-IP检测结果显示，StMYB168与StWRKY20相互作用形成MYB-WRKY 复合物，并调节下游基因表达。
图5 Y2H、BiFC和Co-IP检测验证StMYB168与StWRKY20互作
小源总结直通车
目前，转录因子结合位点及互作的研究方法丰富多样，除了上文介绍的，还有许多技术也可用于转录因子相关研究 。而说完转录因子，相信大家对启动子结构与功能的常用研究技术也满怀好奇。后续，小源也会分享启动子相关研究内容，敬请期待！
下一页
相关新闻
双荧光素酶报告基因是以萤火虫荧光素酶（Firefly luciferase）为报告基因，以海肾荧光素酶（Renilla luciferase）为内参基因，通过同时检测两种荧光素酶，实现对目标基因表达或分子互作的定量分析。
蛋白表达系统可以根据宿主细胞的类型，分为大肠杆菌原核表达系统，毕赤酵母真核表达系统、昆虫杆状病毒表达系统以及哺乳动物真核表达系统，选择正确的蛋白表达系统是实验成功的关键因素。
【全线钜惠】分子/理化服务全线钜惠，助力课题加速！ 【集赞0元享】参与“南京瑞源生物”公众号，免费获取「蛋白互作与结合位点预测」AI分析❗ 一对一技术咨询，售前售后服务保障↓
转录因子是一类可以对基因转录进行调控的蛋白质，通过直接或间接与基因启动子区域中顺式作用元件发生特异性相互作用，增强或减弱RNA聚合酶活性，从而促进或抑制基因的表达，在生物体生长发育、信号转导、生物和非生物胁迫响应方面发挥重要作用
赋能科研，让科研更加简单高效
联系我们
-
电话：400-863-8520；025-57671761
咨询邮箱：market@bestofbest.top
订单问题投诉邮箱：info@bestofbest.top
地址：南京市栖霞区仙林街道齐民西路6号南京仙林智谷3C栋10楼
子公司：南京维百瑞检测技术有限公司
南京瑞源生物
官方客服