解码基因调控核心：转录因子与启动子互作的筛选与验证全攻略
发布时间：
2025-11-18 17:40
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蛋白质与核酸的相互作用是研究基因表达调控机制的关键，目前研究的热点集中于转录因子（TF）与启动子的精准互作。作为基因调控网络的核心环节，二者的结合直接决定基因“何时表达、表达多少”。今天就带大家了解从“候选筛选”到“功能验证”的关键技术，解锁基因调控研究的核心密码。
针对于转录因子与启动子的互作研究，与蛋白-蛋白互作一样，要始终遵循“先大范围筛选候选目标、再针对性验证互作功能”的逻辑。不同研究目的对应不同技术，精准匹配“找线索”和“证因果”的核心需求，避免走弯路。
一、筛选：“海量候选”到“精准靶标”
1、酵母单杂交文库筛选
酵母单杂交（Y1H）是在酵母双杂基础上发展而来的一种研究蛋白-核酸相互作用的工具。
其原理是将Bait DNA序列（靶基因的启动子作为诱饵）整合进入酵母基因组，将大量编码Prey蛋白（猎物蛋白）的基因构建到AD载体中形成待筛选文库，待筛选的基因文库含大量编码转录因子的基因，当Prey蛋白能够识别并结合到Bait DNA序列上时，与Prey蛋白结合的AD结构域可以招募转录复合物，进而激活报告基因的表达，使酵母合成缺陷型培养基上所缺的氨基酸从而在缺陷型培养基上正常生长，对在缺陷型培养基上的酵母进行测序，就能找到与目标启动子互作的转录因子。
酵母单杂筛库原理示意图
2、酵母反向单杂筛选
酵母反向单杂筛选（TF- centered Y1H）是将诱饵蛋白构到AD载体上，待筛选文库是由七个碱基组成的随机motif文库，以AD载体上的基因（编码转录因子的基因）作为诱饵，可以筛选到与该诱饵转录因子互作的motif序列。通过得到的motif序列确定该转录因子可能参与调控的靶基因。
酵母反向单杂筛库原理示意图
3、染色质免疫共沉淀
染色质免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）是一种用于研究细胞内蛋白质与DNA是否相互作用的技术。ChIP技术常与二代测序技术(NGS)结合，形成ChIP-Seq技术（发现未知互作位点）。
其核心原理是通过甲醛等交联剂固定细胞中的蛋白质与DNA复合物，然后利用超声破碎或核酸酶酶切将染色质随机切断为小片段，利用特异性抗体捕获与目标蛋白质结合的DNA片段，最后通过高通量测序检测技术分析这些片段。
ChIP-seq原理示意图
二、验证技术：给互作关系“找证据”
1、酵母单杂交一对一
酵母单杂交一对一（Y1H）技术是将Bait DNA序列整合进入酵母基因组，将Prey蛋白（猎物蛋白）构建到AD载体中，Prey蛋白能够调控靶基因的表达，也就是说Prey蛋白识别并结合到Bait DNA序列上时，与Prey蛋白结合的AD结构域可以招募转录复合物，进而激活报告基因的表达，从而使酵母能在缺陷型培养基上正常生长。
酵母单杂原理示意图
2、凝胶迁移阻滞实验
凝胶迁移阻滞实验（EMSA），全称Electrophoretic Mobility Shift Assay，电泳利用DNA/蛋白质分子带电性，在电场的作用下，带电的DNA/蛋白质分子发生移动，这种移动速度与分子量存在着对应关系，也就是说互作的蛋白-DNA复合物分子量较大，在凝胶中的移动速度较慢；反之，分子量越小（DNA探针），移动速度就越快，越容易跑到凝胶相对更远的位置。
EMSA原理示意图
3、双荧光素酶报告基因
双荧光素酶报告基因（Dual-Luc）系统包括萤火虫荧光素酶（Firefly luciferase）和海肾荧光素酶（Renilla luciferase）。两者可催化各自的底物产生生物荧光，产生的荧光数值大小即表示了两种酶的表达量多少。
通过将启动子区域序列插入LUC的报告基因载体，同时共转入转录因子，当转录因子能与对应启动子结合，则可以转录翻译产生荧光素酶提升荧光值。
双荧光素酶报告基因原理示意图
4、染色质免疫沉淀 - 定量 PCR
染色质免疫沉淀 - 定量 PCR（ChIP-qPCR）是将高效率的ChIP技术和实时荧光定量PCR（qPCR）技术相结合来分析蛋白质-DNA的相互作用，其不仅能够揭示转录因子与DNA的结合情况，还能够对不同位点的结合能力进行量化比较。
ChIP-qPCR原理示意图
不同蛋白-核酸互作验证实验技术对比
三、蛋白-核酸互作的干实验解码
蛋白质与核酸的相互作用是研究基因表达调控机制的关键，传统实验操作复杂且可能无法捕获所有互作相关的蛋白/核酸。
筛选：利用AI智能技术构建高效的数字化高通量选体系——数字化核酸-蛋白互作筛选，可快速实现对海量蛋白或核酸序列的精准建模、互作预测与优化筛选，能够全面筛选并预测可能的蛋白质-核酸相互作用，并提供结构层面的详细信息，极大缩短实验周期，降低实验成本。
数字文库筛选结果表
验证：蛋白互作与结合位点预测分析（AOS），基于AlphaFold建模技术，构建蛋白质的高精度三维模型；利用HDOCK进行快速对接，筛选蛋白-DNA互作的高置信度复合物；针对建模结果进行评分，根据三维模型（远景+近景）结合位点分析图提供全面的互作细节。
核酸与蛋白结合位点预测分析图
层层递进，从筛选到验证，从“结合存在”到“功能明确”，为转录因子-启动子互作提供极具说服力的证据。
注：蛋白-核酸互作的干实验通常需要配合湿实验进行验证
四、文献举例
案例一
以2025年发表在影响因子为10.5的《Plant Biotechology Journal》上的“OsSTK-Mediated Sakuranetin Biosynthesis and Carbon Flux Orchestrate Growth and Defence in Rice”为例。
该研究通过酵母单杂（Y1H）筛选并通过双荧光素酶报告基因等验证到OsSTK可以与OsNOMT的启动子的-0.5-1.0kb区域结合并调控OsNOMT的表达。
而后通过酵母反向单杂筛选到转录因子OsSTK结合的motif称为STKRE，并鉴定到OsNOMT启动子-1.0kb区域内含三个STKRE。而后通过EMSA、双荧光素酶报告基因、ChIP-qPCR实验验证了OsSTK特异性结合OsNOMT启动子中的STKRE区域（图1），促进OsNOMT的表达从而增加樱花素的合成和积累，提高水稻对稻瘟病的抗性。
图1 OsSTK以OsNOMT启动子为靶标。
A. OsNOMT启动子和STKRE结合位点示意图；B. 通过Y1H检测OsSTK和osomt启动子片段之间的相互作用；C. OsSTK激活了OsNOMT的启动子；D. 瞬时表达的相对LUC/REN比值；E. OsSTK可能识别的基序分析；F. EMSA测定OsSTK与OsNOMT启动子的体外结合；G. 通过ChIP检测体内OsNOMT启动子片段上OsSTK的富集。
案例二
以2022年发表在影响因子为6.9的《Plant Physiology》上的“The R2R3-MYB transcription factor FaMYB63 participates in regulation of eugenol production in strawberry”为例。
研究通过酵母单杂交（Y1H）筛选到草莓中一个与基因FaEGS 1（与丁香酚合成相关的酶）启动子互作的R2R3型转录因子——FaMYB 63（图2）。研究通过EMSA、Y1H以及GUS染色等实验验证FaMYB 63正调控丁香酚合成的三个关键基因（FaEGS1、FaEGS2和FaCAD 1）的表达（图3，4）。
而后研究又发现FaMYB 63的沉默诱导了FaEOBII和FaMYB 10转录物水平的显著降低，通过EMSA、Y1H、GUS染色和双荧光素酶报告基因分析表明，FaEOBII和FaMYB10的转录受FaMYB63的调控（图5，6）。
综上所述，FaMYB63直接激活FaEGS1、FaEGS2、FaCAD1、FaEOBII和FaMYB10，诱导草莓果实发育过程中丁香酚的生物合成。
图2 FaMYB63与R2R3-MYB蛋白的比对。
图3 FaMYB63直接与FaEGS1、FaEGS2和FaCAD1启动子相互作用。
FaMYB63与FaEGS1 (A)、FaEGS2 (C)和FaCAD1 (E)启动子之间的EMSA结果；在Y1H系统中，FaMYB63特异性结合FaEGS1 (B)、FaEGS2 (D)和FaCAD1 (F)的启动子。
图 4 FaMYB63调控FaEGS1、FaEGS2和FaCAD1的转录。
A，转基因本氏烟草叶片瞬时表达分析和GUS染色结果示意图；B. 双荧光素酶报告基因验证FaMYB 63能够结合FaEGS1、FaEGS2和FaCAD1的启动子。
图 5 FaMYB63结合FaEOBII和FaMYB10启动子。
重组FaMYB63蛋白与FaEOBII (A)和FaMYB10 (C)启动子结合的EMSA分析； 酵母单杂验证FaMYB63与FaEOBII (B)和FaMYB10 (D)启动子结合。
图 6 FaMYB63调控FaMYB10和FaEOBII的转录。
A. 转基因本氏烟草叶片瞬时表达分析和GUS染色结果示意图；B. 双荧光素酶报告基因验证FaMYB 63能够结合FaMYB10和FaEOBII的启动子。
五、研究热点：解锁更多应用场景
✔作物育种：挖掘调控高产、抗病相关基因的转录因子，通过编辑转录因子优化启动子结合效率，培育优质品种；
✔疾病研究：解析人类癌基因转录因子与靶启动子的异常互作，开发靶向干预药物；
✔环境响应：探究胁迫条件下（如干旱、盐碱）转录因子-启动子互作的动态变化，解析植物抗逆机制。
小源小结
转录因子与启动子的互作研究，关键在于“筛得准、验得实”。
根据研究阶段选对技术，再通过组合实验构建证据链，就能高效解锁基因调控的核心密码～
各位小伙伴们在研究中会常用哪些技术？欢迎大家在评论区里交流！
看完上面的技术拆解，研究思路是不是已经清晰明了？但实验中难免会遇到 “抗体质量不稳定”“转染效率低”“文库筛选耗时长” 等棘手问题，是不是很头疼？
别担心！小源针对蛋白 - 核酸互作研究全流程，定制了从 “筛选” 到 “验证” 的一站式解决方案，帮您精准避坑、高效推进，省时又省心～
参考文献
[1] Hu J ,Li L ,Zhao Y , et al.OsSTK-Mediated Sakuranetin Biosynthesis and Carbon Flux Orchestrate Growth and Defence in Rice.[J].Plant biotechnology journal,2025,DOI:10.1111/PBI.70358.
[2] Shuaishuai W ,Mengyun S ,Yang Z , et al.The R2R3-MYB transcription factor FaMYB63 participates in regulation of eugenol production in strawberry.[J].Plant physiology,2022,188(4):DOI:10.1093/PLPHYS/KIAC014.
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双荧光素酶报告基因是以萤火虫荧光素酶（Firefly luciferase）为报告基因，以海肾荧光素酶（Renilla luciferase）为内参基因，通过同时检测两种荧光素酶，实现对目标基因表达或分子互作的定量分析。
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