项目文章 | 四川农业大学玉米研究所利用MTP桥梁材料助力创制抗病耐逆矮秆玉米种质
发布时间：
2024-10-17 14:38
来源：
前言
矮化性状代表着高产、耐肥、抗倒伏等优良特性，是小麦、水稻、玉米等多种农作物选育优良高产品种的重要研究方向。
玉米的矮化育种主要集中在Br2基因上，但单一基因的应用限制了遗传多样性。因此，需要通过自然突变、人工诱变和遗传工程等方法来创造和识别新的矮化资源。远缘杂交是一种有效的策略，可以克服杂交障碍，将野生型基因渗入作物中，从而创造新的矮化种质资源。
近日四川农业大学玉米研究所博士周阳为第一作者，唐祈林教授为通讯作者，在期刊International Journal of Molecular Sciences PBJ（中科院一区TOP ，IF=10.1）发表了题为 “Maize-Tripsacum-Teosinte allopolyploid (MTP), a novel dwarf mutant inducer tool in maize”的研究论文。该研究利用玉米-大刍草-摩擦禾异源六倍体MTP为桥梁材料，与玉米杂交、回交创制抗病虫、耐逆等重要农艺性状的MTP-玉米渐渗系种质，发现了系列的新半矮秆性状材料。
研究内容
建立并分析MTP远缘杂交玉米的矮化种质库
通过MTP与玉米品系进行远缘杂交诱变，成功创制了10余份新半矮秆性状材料。其中，5份矮秆材料展现稳定且优秀的矮化表型，这些矮化表型表现植株均匀缩短、雌雄协调等性状。
进一步对5份半矮秆材料进行系统的等位性、遗传方式和激素响应的鉴定，它们均与矮秆基因Br2不等位，且5份种质矮化基因相互也不等位，以单基因遗传控制为主，激素响应分别为赤霉素敏感型、油菜素内酯敏感型、赤霉素和生长素不敏感型等类型，其中d024为油菜素内酯（BR）敏感型。
图 1 MTP远缘杂交玉米的矮化种质库创制示意图
定位矮化基因d024和变异来源分析
对早期发现的一份MTP-玉米矮秆d024进行了系统研究，与野生型（H024）相比，d024的节间数量与H024相似，而穗位及其上方所有节间显著缩短。
细胞学观察发现，与野生型相比，d024的穗茎节纵向切割细胞的长度显著减少。这表明，茎节间的细胞长度减少促成了d024的矮化表型。
通过遗传分析，d024表现出隐性单基因遗传模式。首先，使用d024×H024的F2代群体的极端高矮株混池，通过BSA-seq（混合分组分析）方法对d024进行初定位，基于B73参考基因组（RefGen_v4）分析，确定了 3 号染色体上与 d024 矮化相关的独特基因组区域（4.1 Mb）。
然后进一步缩小d024矮化性状的候选区间，增加多态性标记用于基因型鉴定，在F2代群体中708个矮化单株，分子标记558， indel-5589和indel-5598分别揭示了21、20和27个重组事件，表明候选基因定位在标记558和indel-5589之间大约7.6 kb的物理距离。根据B73_RefGen_v4，发现只有一个候选基因（Zm00001d039453）位于该区域。
对候选基因进行克隆发现，该候选基因检测到9个SNP/Indels。SNP-8和indel-7显示出了核酸的变化，都导致了氨基酸的变化。
此外，在候选基因的启动子上发现了一个191 bp的indel-4缺失，导致BRRE启动子元件丢失，启动子活性降低。
更重要的是，在28个玉米自交系、5个大刍草种质和1个摩擦禾（MTP亲本）中对indel-4启动子进行了基因分型。所有玉米自交系和大刍草均未携带indel-4缺失，只有摩擦禾（MTP的亲本）与d024的indel-4的核酸序列一致。
因此，该研究将控制d024株高的关键候选基因确定为Zm00001d039453， ZmCYP90D1。
图 2 矮化基因d024的定位克隆和变异来源分析
基因敲除验证ZmCYP90D1 作用
用CRISPR/Cas9技术在玉米自交系B73背景下培育了Zm00001d039453基因敲除突变体，以评估该基因的突变是否引起了矮化表型。结果表明产生的KO#1（zmcyp90d1–1）和KO#2（zmcyp90d1–2）显示出与d024突变体相似的半矮化表型，且ZmCYP90D1在茎中的表达水平显著低于B73。证实了d024的植物矮化表型是由ZmCYP90D1基因的缺失引起的。
过表达ZmCYP90D1基因在拟南芥AtOE#1和AtOE#2株系，发现AtOE#1和AtOE#2株系的高度和ZmCYP90D1的基因表达水平均高于B37株系。
通过筛选了T-DNA插入突变体SALK-036476（AT3G13730）以验证ZmCYP90D1在拟南芥中的同源基因功能。在开花结束时，SALK-036476株系的高度和AT3G13730的基因表达水平比均低于对照组。表明ZmCYP90D1正调控作物的株高。
图 3 ZmCYP90D1正调控作物的株高
ZmCYP90D1与转录因子ZmBES1/BZR1-5的互作
ZmBES1/BZR1-5是一个重要的转录因子，可以直接结合到目标基因启动子中的BRRE元件, motif分析在 ZmCYP90D1 的 indel-4 区域鉴定了一组保守的核心 BRRE，表明它们是 ZmBES1/BZR1-5 的潜在靶标。使用CYP90D1B73(inel-4) 和 CYP90D1Tripsacum(inel-4)启动子进行了Y1H（酵母单杂）测定。ZmBES1/BZR1-5在 CYP90D1B73(inel-4)启动子中的转录活性比 CYP90D1Tripsacum(inel-4) 强。
烟草瞬时表达分析，由35S启动子驱动的 ZmBES1/BZR1-5 的编码序列用作效应子，B73和摩擦禾中CYP90D1的indel-4启动子作为报告基因，结果表明CYP90D1Tripsacum报告基因的LUC活性低于CYP90D1B73。
电泳迁移率实验（EMSA），表明ZmBES1/BZR1-5可以结合到indel-4区域的BRRE基序，因此191 bp（indel-4）的缺失抵消了其对ZmBES1/BZR1-5转录的影响。
使用Y2H（酵母双杂分析）筛选ZmFDXs和ZmNAD(P)H与ZmCYP90D1的相互作用。在本氏烟草中进行双分子荧光互补（BiFC）、分裂荧光素酶互补成像（Split-LUC imaging），观察到当共渗透ZmCYP90D1-n YFP和ZmFDXs-C YFP，ZmCYP90D1-n YFP和ZmNAD(P)H-C YFP时，在表皮细胞的膜系统中重组了黄色荧光蛋白（YFP），以及烟草叶细胞中的荧光素酶活性，结果表明ZmCYP90D1在体内与ZmFDXs和ZmNAD(P)H相互作用。
图 4 ZmBES1/BZR1-5-ZmCYP90D1-ZmFDXs/ZmNAD(P)H模块控制BR生物合成途径
ZmCYP90D1调节激素及其阶段
三种植物激素（IAA、GA3和表油菜素内酯epiBL）的处理结果表明， 100μg/L的epiBL浓度促进了d024的纵向茎节的延伸。通过幼苗水培，发现随着epiBL浓度的升高，d024的植物高度增加，而GA3和IAA对d024的茎伸长没有明显影响。检测d024、KO#1和WT中的BRs，发现三者之间没有显著差异。
进一步分析BRs的前体物质，发现矮化表型（d024和KO#1）中的油菜素甾酮（CS）和香蒲甾醇（TY）含量低于WT。作为油菜素内酯（BR）功能的28-高油菜素内酯（28-high-BR）含量也在d024和KO#1中较低。表明，d024为BRs缺乏的矮化突变体。
检测B73和KO#1植物节间的六个与BR相关的基因的表达水平，发现ZmDWF1/na2在BR合成的早期阶段没有显著变化。在后期阶段，ZmDwf4和ZmBrd1表现出显著的表达，伴随着与BR信号传导途径相关的基因的显著下调。
因此认为，ZmCYP90D1的调节主要发生在BR生物合成的后期阶段。
图5 ZmCYP90D1调节BR合成途径的下游
ZmCYP90D1的调控机制
因此，提出了一个工作模型来说明ZmCYP90D1如何通过控制节间分生组织的形成和节间细胞的伸长来调节玉米的株高。
矮秆基因ZmCYP90D1的表达由上游转录因子ZmBES1/BZR1-5调控，从而影响ZmCYP90D1与ZmFDXs、ZmNAD（P）H的相互作用，调控茎节间油菜素内酯含量变化控制茎节间细胞的伸长，进而影响植株株高。
图 6 CYP90D1B73 和 CYP90D1Tripsacum 对玉米株高影响的工作模型
indel-4的应用在种植中的表现
将来自四倍体摩擦禾的indel-4，通过反复回交和分子标记辅助选择，成功将其导入Mo17自交系，创造了新的矮化玉米材料Mo17d024。
在2023年中国崇州和温江的田间试验中，改良F1（B73d024 ×Mo17d024）在高种植密度下的植物高度低于对照杂交种，且茎直径更大。与原始F1（B73 × Mo17）相比，改良F1在高密度种植下的产量能够达到持平且稳产，收获指数也更高。
这些结果表明，indel-4的应用可以提高玉米在密集种植条件下的产量潜力和收获指数。
图7 四倍体摩擦禾矮秆等位基因确保了高密度种植下的产量潜力和更高的收获指数。
综上，该团队开发以四倍体多年生大刍草、摩擦禾和玉米三物种聚合体的玉米-大刍草-摩擦禾异源六倍体MTP为桥梁材料，与玉米杂交、回交，创制抗病、抗虫、耐逆、矮秆等重要农艺性状的MTP-玉米渐渗系新种质，为构建具有更强抗生物、非生物胁迫性和利用矮秆等新性状的玉米类作物品种提供了机遇。本研究利用MTP创制玉米矮秆新资源为矮秆玉米育种提供了一种新途径和新资源。
项目介绍
该研究署名南京瑞源生物技术有限公司为其提供油菜素内酯含量测定
瑞源生物&维百瑞检测建立了一种基于LC-MS/MS平台的植物激素分析方法，高通量检测包括生长素、赤霉素、细胞分裂素、脱落酸、茉莉酸、水杨酸在内的6大类植物激素。
定量分析采用同位素稀释法，可获得植物激素绝对含量。通过高效样品预处理技术对植物激素进行富集、纯化，结合高效液相色谱(HPLC)出色的分离能力和串联质谱(MS/MS)的高选择性，可有效降低复杂的样品基质对检测的干扰，进而提高植物激素的检测灵敏度，确保分析结果的可靠性。
活动详情
为回馈广大客户，致敬辛勤奉献的科研工作者们，特此推出“维百瑞检测科研五周年庆”活动，折扣、礼品应有尽有！
