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    酵母文库构建应该怎么选?,SMART还是Gateway?


    酵母文库类似于一个储存大量外源基因片段的仓库,利用酵母细胞作为载体,将外源基因片段插入到酵母菌内,形成一个包含大量基因片段的集合。酵母文库可以用于研究基因的功能、表达、互作等各个方面,是生物学研究中的重要工具之一。当把我们研究的目标基因成功构建到载体上,并成功构建酵母文库,可以便捷得用于包括筛库等各项后续实验。

    通过酵母文库技术,可以构建全基因组的蛋白质互作网络,分析蛋白质的结构、功能、调控和演化,发现新的蛋白质和信号通路。如酵母双杂是利用酵母文库研究蛋白质互作的经典策略。

     

    图1 核酵母双杂基本原理

     

    利用酵母文库进行蛋白组学、基因组学等研究,不仅更加经济便捷,而且作为经典思路被广泛认可。

    酵母菌作为一种真菌,在生物技术实验上发挥了巨大作用,酵母文库的构建方法,目前比较主流的包括SMART和Gateway两种,两种技术适用于不同的条件和需求。

    SMART技术是由Clontech于1996年开发的,SMART技术的名称来源于switching mechanism at 5’ end of RNA template的缩写,最初用于构建哺乳动物cDNA文库,后来也用于构建酵母cDNA文库。SMART技术的原理是利用反转录酶的模板切换活性,将特异性的序列加到cDNA的5’端,从而提高全长克隆的效率。

    Gateway技术是由Invitrogen于1999年开发的,最初用于构建无限制性酶切位点的克隆载体,后来也用于构建酵母文库。Gateway技术的原理是利用细菌噬菌体λ的重组系统,将特异性的重组序列加到DNA片段的两端,从而实现不同载体间的DNA转移。

     

    SMART和Gateway实验步骤对比

     

    建库材料选择

    酵母文库构建的材料可以选择植物组织、动物组织/细胞、菌液或完成提取未降解的RNA。

    提取的RNA经琼脂糖凝胶电泳应能清晰看到28S和18S两条带;经分光光度仪检测,OD260/OD280应在1.8-2.2之间,OD260/OD230应大于2。

     

    SMART和Gateway技术对比

     

    SMART技术和Gateway技术都是酵母文库构建的有效方法,但是它们各有适用的条件和需求。一般来说,如果起始RNA量少,或者需要富集低丰度表达基因,或者需要包含5’非翻译区的序列,可以选择SMART技术;如果起始RNA量多,或者需要在不同的表达载体间进行DNA转移,也可以选择Gateway技术。

    当然,科研过程中,并不是越复杂的实验操作带来的结果就更加真实可靠,相反,过于复杂繁琐的操作更容易造成移码等不好的结果。尽管Gateway法的初级文库经过扩繁理论上可以进行无限次使用,但随着时间的推移,菌液质量下降可能会对实验结果造成影响。

    相比于Gateway法,SMART法有着更简便的实验操作,需要更低的RNA起始量,经过均一化操作有效富集低丰度表达基因,降低冗余序列比例,同时,SMART法能合成完整的包括5‘非翻译区的基因信息,提高全长克隆的比例。

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