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    更低假阳性概率的蛋白互作研究技术——免疫共沉淀Co-IP


    技术背景

    蛋白质作为生命活动的重要分子之一,发挥着关键的作用。蛋白质的作用大多通过蛋白质之间的相互作用得以发挥,众多研究蛋白质互作的技术被开发出来。其中Co-IP全称Co-immunopreciptation,即免疫共沉淀,是一项被广泛使用的工具之一。

    免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法,用于确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用。与其他蛋白互作研究技术,比如酵母双杂、Pull-down等各有优势,其中Co-IP基于抗原和抗体之间结合,可以从复杂的细胞裂解液中特异性地分离和鉴定蛋白质复合体,对于理解蛋白质如何在细胞内相互作用以及它们如何影响细胞功能和信号传导至关重要。

     

    技术原理

    要了解Co-IP的技术原理,那么我们首先来研究一下这个名字。

    Co-IP自然的可以拆解成Co和IP两部分。比如cooperation表示合作的意思,co-典型的英语前缀,表示共同,一起的意思。

    IP则是immunopreciptation(免疫沉淀),IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“protein A/G"特异性地结合到抗体(免疫球蛋白)的FC片段的现象开发出来的方法。目前多用protein A/G预先结合在argarose beads上,使之与含有抗原的溶液及抗体反应后,beads上的prorein A/G就能达到吸附抗原的目的。通过低速离心,可以从含有目的抗原的溶液中将目的抗原与其它抗原分离。

     

     

    实验流程

    构建融合表达载体

    转化农杆菌

    烟草瞬时表达

    提取烟草叶片总蛋白

    表达分析鉴定

    免疫共沉淀

    Western blot互作检测

     

    Co-IP适用场景

    (1)可以用于两种目标蛋白是否体内互作的检测

    (2)适用于分离得到自然状态下相互作用的蛋白复合物

     

    文献案例

    2024年发表在PLANT CELL AND ENVIRONMENT上发表的文章ZmABF4-ZmVIL2/ZmFIP37 module enhances drought tolerance in maize seedlings。

     

     植物同源结构域(PHDs)在广泛的真核生物中被鉴定为应激反应基因。然而,在非生物胁迫条件下,玉米PHD基因的调控机制在很大程度上仍是未知的,ZmVIL2 属于 PHD 蛋白家族。与WT相比,ZmVIL2突变体对干旱胁迫的敏感性更高。ZmVIL2的过表达始终增强了玉米的抗旱性。

    Y2H、BiFC 和 Co-IP 实验表明,ZmVIL2 直接与 ZmFIP37相互作用。为研究 ZmVIL2与ZmFIP37相互作用,分别利用酵母双杂、BiFC、Co-IP进行了实验。

     

    蛋白互作相关实验关联关系

    Co-IP主要功能还是用于蛋白互作的检测,研究蛋白互作的实验方法众多,与应用较为广泛的比如酵母双杂、pull-down这类技术相比,Co-IP实验有什么优势及不足呢,他们之间又是什么样的关系呢?

    按研究的进程排序,我们先从酵母双杂说起,关于酵母双杂大家如果想要深入了解的可以去看小瑞之前的文章 

    通过酵母双杂这一体内实验我们验证了蛋白可能互作,但由于酵母双杂假阳性率高这一缺点,导致是否互作还需要进一步验证。

    这时候,假阳性概率相对更低的Co-IP实验就可以发挥出作用,蛋白质的相互作用可以在天然状态下进行,避免人为影响,还可以分离得到天然状态下相互作用的蛋白复合体,可以在双杂基础上进一步对互作进行验证。但是通过酵母双杂和Co-IP实验都不能证明这种互作是直接的还是间接的。

    这种情况下,可以选择进行GST pull-down实验,GST pull-down实验为体外实验,可以去除其它蛋白的影响,从而确定目的蛋白和待检测蛋白是否可以发生直接相互作用。

    南京瑞源生物可以提供包括酵母双杂、Co-IP、GST pull-down实验在内的蛋白互作验证全链路实验服务。

     

    服务内容及交付结果

    1、免疫共沉淀高清原始图片及分析结果原始数据

    2、标准实验报告和western blot鉴定结果 

    3、剩余材料返还

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    更低假阳性概率的蛋白互作研究技术——免疫共沉淀Co-IP

    免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法,用于确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用。与其他蛋白互作研究技术,比如酵母双杂、Pull-down等各有优势,其中Co-IP基于抗原和抗体之间结合,可以从复杂的细胞裂解液中特异性地分离和鉴定蛋白质复合体,对于理解蛋白质如何在细胞内相互作用以及它们如何影响细胞功能和信号传导至关重要。


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