抗逆基因筛选及表型验证的理想模型—酵母
发布时间：
2024-03-05 11:11
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基因参与调节生物体对胁迫的抗性，在抗逆基因的研究过程中，如何在一些待选基因中筛选出某种胁迫的抗性基因？又或是如何利用酵母验证某个基因对某种胁迫的抗性？
酵母是一种单细胞的真核生物，在培养基上可以快速生长。酵母菌和植物的表达系统更为接近，也具有糖基化、二硫键形成及蛋白质折叠、翻译后加工等过程，从而使得筛选出的植物基因所编码的蛋白功能正常发挥，验证的逆境抗性基因假阳性的概率大大降低。因此酵母成为了验证基因抗性的理想模型。
酵母抗逆验证模型菌株选择
酵母菌有着真核生物表达系统，因此可以在动植物体外对某抗逆基因的表型功能进行验证筛选，包括盐胁迫、干旱胁迫、高低温胁迫、农药等。在该实验过程中酵母菌株的选择也是十分重要的，应选择对应的逆境胁迫的高敏感型菌株，可以有效提升实验的可行性，并减少实验结果的假阳性概率。
2023年在Plant Physiology and Biochemistry上发表的论文Two novel transporters NtNRAMP6a and NtNRAMP6b are involved in cadmium transport in tobacco (Nicotiana tabacum L.)在研究中使用突变后的镉敏感型菌株Δycf1，锰敏感型菌株Δsmf1，铁敏感型菌株Δccc1与野生型菌株BY4741转入同类型载体的情况下在Cd、EGTA、Fe高浓度环境下表现出更明显的表型变化。
酵母中进行抗逆基因表型筛选验证时通常使用INVSC1菌株研究耐盐、耐干旱逆境筛选；BY4741菌株用于高温、低温筛选；Δycf1用于耐镉逆境筛选；W303用于农药相关筛选。
酵母抗逆验证载体选择
在进行酵母抗逆基因筛选验证时实验常用载体pYES2-NTB，该载体为检测重组蛋白在酵母中诱导表达情况而设计，该载体含有诱导型启动子GAL，在半乳糖存在的情况下，大量诱导外源蛋白表达，而在葡萄糖存在的情况下，抑制外源蛋白表达。且含有URA3基因，可用于SD-URA板筛选。
酵母抗逆验证案例
01 温度胁迫
2023年发表在Frontiers in Plant Science上的文章Tung tree stearoyl-acyl carrier protein Δ9 desaturase improves oil content and cold resistance of Arabidopsis andSaccharomyces cerevisiae，利用酵母BY4741研究基因VfSAD和基因VfSAD2在低温胁迫下的功能，通过在酵母菌株中转入重组构建的含有VfSAD1和VsSAD2基因的质粒载体，分别在30℃和17℃条件下培养，通过观察酵母菌生长状况及菌液OD值，为VfSAD1/2在响应低温条件下的作用提供依据。
02 盐胁迫
2023年发表在Plant Science上的文章The Na+/H+antiporter GbSOS1 interacts with SIP5 and regulates salt tolerance in Gossypium barbadense，为探究GbSOS1及SIP5基因相互作用对棉花耐盐性的影响，其中研究使用pYES2（INVSC1）菌株，通过转入GbSOS1基因，在不同NaCl浓度的培养皿上的生长状况及菌液OD值，为GbSOS1在耐盐方面的作用提供证据支撑。
03 Cd胁迫
2023年发表在International Journal of Biological Macromolecules的文章Metallochaperone protein OsHIPP17 regulates the absorption and translocation of cadmium in rice (Oryza sativa L.)，为探究OsHIPP17对水稻耐Cd性的影响，在酵母菌中转入OsHIPP17基因通过25μMCd处理，通过观察酵母菌生长状况及菌液OD值变化，为OsHIPP17在Cd转运方面的作用提供依据。
04 干旱胁迫及盐胁迫
2023年发表在International Journal of Biological Macromolecules的文章Overexpression of the white clover TrSAMDC1 gene enhanced salt and drought resistance in Arabidopsis thaliana，为探究TrSAMDC1对拟南芥耐盐性及抗旱性的影响，通过观察酵母菌生长状况及菌液OD值变化，为TrSAMDC1在拟南芥耐盐及耐寒性方面的作用提供依据。
05 干旱胁迫
前面的文章我们主要简要概述了文章中关于利用酵母进行抗逆基因研究的案例，下面我们利用这篇文章，看一下这篇文章的研究者具体是如何完成研究的。
文章是2023年发表在Plant Science上的Transcriptomic analysis of ncRNAs and mRNAs interactions during drought stress in switchgrass。
这篇文章的主要目的是探索非编码RNA（ncRNA）柳枝稷（switchgrass）抗旱过程中的作用和调控机制。柳枝稷是一种重要的生物能源作物，也是一种生态草种，可以改善土壤质量。ncRNA是一类不编码蛋白质的RNA分子，包括lncRNA，circRNA和miRNA。它们在植物的基因表达和应对逆境中发挥重要的作用，但是在柳枝稷中的研究还很少。
研究利用全转录组测序技术，分析了正常和干旱处理的柳枝稷叶片中mRNA和ncRNA的表达变化。研究发现了12511个差异表达的mRNA，59个差异表达的miRNA，38个差异表达的circRNA和368个差异表达的lncRNA。其中，上调的mRNA主要富集在淀粉和蔗糖代谢途径中，这可能是柳枝稷抵抗干旱的一种策略。
通过共表达分析，研究发现DE lncRNA可能在转位（trans）和顺位（cis）调控了1308个和7110个蛋白编码基因，这些基因也参与了一些与干旱相关的代谢途径。
构建了竞争性内源RNA（ceRNA）网络，揭示了lncRNA和circRNA通过miRNA反应元件（MRE）与miRNA的相互作用。并验证了其中一个靶基因淀粉合成酶4（PvSS4）的功能。通过过表达PvSS4，发现它可以显著提高酵母的抗旱能力，但是对盐胁迫的作用并不显著。
产品介绍
抗逆基因筛选及验证服务
南京瑞源生物提供酵母高通量抗逆基因筛选及验证服务。这项服务主要包含两个方面，即筛选和验证。
筛选就是在逆境筛选系统下，通过抗性梯度实验对基因组范围内的抗性相关基因进行筛查，利用蛋白组学寻找候选蛋白。
验证则是对候选蛋白，利用抗性培养基验证其对该胁迫的响应。
酵母逆境筛选试剂盒
南京瑞源生物产品线提供酵母逆境筛选试剂盒，试剂盒内配备有不同逆境条件适用的INVSC1、BY4741、Δycf1、W303四种菌株，均可以与pYES2-NTB载体配套使用。该试剂盒可满足多种逆境条件，用于单基因的逆境验证与逆境文库筛选。
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