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服务描述
酵母表达系统是研究真核蛋白质表达和分析的有力工具，毕赤酵母表达系统是近年来发展迅速、应用广泛的一种真核表达系统。
酵母具有与其他真核生物类似的蛋白质分泌途径，外源基因的分泌表达，不仅方便了表达产物的分离纯化，同时具有翻译后产物的修饰能力。
基本原理
在毕赤酵母中常用的强启动子包括甲醇诱导的AOX1启动子和持续活跃的GAP启动子。
AOX启动子是一种甲醇诱导型启动子，是目前在毕赤酵母中常用的高效诱导型启动子。当甲醇为唯一碳源时，AOX1启动子可被甲醇诱导，启动醇氧化酶的表达，从而用甲醇进行代谢，含AOX1启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的基因的表达。
GAP启动子是一个组成型启动子，可以在多种碳源下表达，不需要像甲醇诱导的A0X1启动子那样改变培养基成分。组成型启动子提供简单性和相对恒定的表达水平。
技术优势
1、高表达量：使用强启动子，实现外源蛋白在酵母中的高水平表达
2、翻译后修饰：作为真核细胞，酵母能进行蛋白质折叠和翻译后修饰功能
3、分泌表达：α-factor信号肽引导分泌表达，有利于目的蛋白的纯化和积累
4、稳定转化：得到具有稳定长期表达能力的菌株
实验流程
样品要求
类型
送样标准
运输条件
需要基因合成的序列
无
无
构建好的质粒
中间载体质粒
浓度>100ng/ul，体积>20ul；提供载体序列和抗性，无污染。
冰袋
含构建好质粒的菌液
含中间载体质粒的菌液
体积>500ul；提供载体序列和抗性，无污染。
干冰，1天（5kg）2-3天（10-20kg）3-5天（20-30kg）
平板菌
无污染
常温
服务内容
服务内容 周期（工作日） 交付材料 基因合成（密码子优化） 15个 1、表达质粒（2 μg左右）
2、蛋白样品 ≥ 500 μg
3、标准的蛋白表达服务报告
4、最优克隆菌株甘油1 ml（收费）2、表达鉴定:
（1）筛选阳性克隆（PCR）（质粒线性化，电转化，抗性筛选克隆）
（2）表达诱导（7个克隆，WB 结果）14个 3、表达纯化：最优克隆 50 ml表达纯化 10 个 4、最优克隆菌株 1 个 案例报告
把保存的7个克隆用于表达小试。表达结束后，吸取20 μl 上清，加入5μl 5x蛋白loading buffer，混匀后于 100℃煮沸 5-10 min，吸取 20 μl 进行 Western Blot 鉴定。结果显示，7个克隆均表达成功(图1)。
图1 蛋白表达检测
WB检测目的蛋白表达情况。M：Maker，1-7：目的蛋白表达，8：阳性对照(eGFP蛋白-28KD)蛋白纯化与浓度测定
为了获得大量纯化的目的蛋白，我们将扩大表达的蛋白进行 Ni-NTA beads 纯化，纯化后用 SDS-PAGE 和 Western Blot 检测，并用 BCA 法测定其浓度。结果表明，蛋白样品纯化成功，未有其它杂带（图2）。
图 蛋白纯化检测
考染检测目的蛋白纯化情况，M：Maker，1：纯化蛋白，2：阳性对照
WB 检测目的蛋白纯化情况，M：Maker，1：纯化蛋白，2：阳性对照常见问题及解答
酵母蛋白表达的影响因素：
1、启动子的选择：酵母表达系统常用的是醇氧化酶基因启动子AOX，具有强诱导性和强启动性。GAP启动子是毕赤酵母中克隆到的一个组成型启动子，在GAP启动子控制下，LabZ基因表达比甲醇诱导下表达量更高，且不需要甲醇诱导，放大工艺更加简便。
2、目的基因的优化：目的基因决定表达成败的首要因素。由于密码子的简并性，不同的表达系统都有其特定的偏爱密码子。所以在基因合成时便要进行密码子的优化(可见密码子优化详解)，换掉稀有密码子并进行mRNA结构优化，提高蛋白表达量，防止蛋白不表达或表达量低。
3、影响蛋白分泌的因素：如果蛋白本身不易分泌，即不适分泌表达，可在表达载体上插入a-factor信号肽序列，提高蛋白分泌表达水平。
酵母蛋白表达与大肠杆菌表达的区别
1、酵母蛋白表达与大肠杆菌表达部分不同，大肠杆菌表达只需将质粒/载体转入到宿主菌体内，其载体携带复制原点随着宿主染色体的复制而复制，可以稳定存在。而酵母表达相对复杂，设计的质粒/载体均不带有酵母自身复制原点，因此如果直接导入到宿主菌中，不能稳定存在。所以需要以同源重组的方式与宿主菌染色体整合才能产生稳定转化的菌株。
2、酵母表达可以进行翻译后修饰，产生糖基化、二硫键、三级结构等，所以得到的重组蛋白分子量往往大于理论分子量。而大肠杆菌不具备翻译后修饰能力。
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