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荧光定量

▼服务简介

实时荧光定量PCR技术是生命科学领域的一项重要技术,是快速检测基因表达水平的首选方法,是一种在DNA扩增反应中,以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法,通过内参(相对定量)或者外参法(绝对定量)对待样品中的特定DNA序列进行定量的分析。

该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃,与常规PCR相比,它具有灵敏度更高、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点,已成为国际公认的核酸分子定量的标准方法。

▼实验原理

实时荧光定量PCR技术(Real-time Quantitative PCR,qPCR)是指在PCR反应体系中加入可与DNA产物特异性结合的荧光基团(包括荧光染料或荧光标记的特异性探针),对PCR产物进行标记跟踪,随着PCR反应的进行,反应产物不断累积,荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环,收集一次荧光强度信号,这样即可通过荧光信号强度的变化实时监测整个PCR过程中产物量的变化,并结合相应软件对产物进行分析,可以得到荧光扩增曲线,从而计算待测样品中目的基因初始模版的量,常用于分析目的基因的表达水平的变化。

▼技术优势

1、我们使用罗氏的Lightcycler的荧光定量PCR仪器,高灵敏度、高重复性、高分辨率、动力学范围广,仪器稳定性有保障,数据能够比较真实的反映出样品中RNA的相对含量变化。

2、荧光定量PCR检测实验中所用的试剂耗材搭配是经过我们多年的实验经验筛选优化,大多为进口的试剂耗材,首选质量,其次是成本。

3、我们检测的样本包含多个物种(人、小鼠、大鼠、昆虫、线虫、水稻、棉花、葡萄、桃花等),针对不同的物种材料,我们有不同的内参设计方案,并非一律使用GAPDH或β-actin,科学的内参设计方案更加有利于提高荧光定量PCR数据可靠性。

4、多年的荧光定量PCR实验经验,2014年检测量超过10万反应,批量化的流水线作业减少个体实验的误操作差异概率

▼服务流程

1、根据基因序列设计特异性的引物或荧光探针 

2、提取样品 DNA/ RNA、电泳检测、反转录 

3、RealTime PCR(荧光定量PCR),进行扩增曲线、溶解曲线、表达量差异分析等实验 

4、实验完成后,提供完整的实验报告(含软件分析结果)及引物等实验材料

▼服务内容

相对定量qPCR包括:

mRNA引物/探针设计以及表达检测服务

lncRNA引物/探针设计以及表达检测服务

miRNA引物/探针设计以及表达检测服务

circRNA引物/探针设计以及表达检测服务

对各类型样本中各种RNA差异表达相对定量。每个样本重复三次,我公司可提供常用内参基因引物。

▼交付内容

1、RNA提取及检测电泳图片

2、检测数据(默认三次重复),2^-ΔΔCt分析数据

3、相对定量比对柱状图

4、扩增曲线及熔解曲线图

5、荧光定量PCR检测报告

▼案例展示

荧光定量PCR绝对定量PCR-标准曲线绘制

绝对定量是用已知浓度的标准品绘制标准曲线来推算未知样品的量。一般我们将待测的基因序列装入已知大小的质粒中作为标准品,将标准品稀释至梯度浓度,作为底物模板进行荧光定量PCR反应。以标准品拷贝数的对数值为横坐标,以测得的CT值为纵坐标,绘制标准曲线。当检测未知样品时,使用与标准质粒相同的反应条件和相同的引物序列,扩增得出CT值,即可在标准曲线中计算出样品中目的基因拷贝数。

            扩增曲线

 

            溶解曲线

 

            标准曲线

▼常见FAQ

1、SYBR-Green染料法与TaqMan荧光探针法,这两种荧光定量PCR方法有什么区别?

SYBR-Green染料法:染料能够与双链结合,当PCR扩增的时候,能特异性地渗入DNA双链后,发射荧光信号,而不掺入链中的染料分子不会发射荧光信号,从而保证荧光信号与PCR产物的增加完全同步。适用于任何DNA,无需设计探针,采取双标准曲线法,实验周期短,结果重复性好,灵敏度高。

TaqMan荧光探针法:PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,该探针为一寡核苷酸,两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。经验丰富的实验技术人员设计探针,对目标基因有高特异性,实验重复性好,相对于SYBR Green法,灵敏度更高。

2、客户除了提供样品外,还需要提供哪些信息?

样品类型:组织/细胞/RNA/cDNA;

物种信息

目的基因的序列、GeneBank编号;客户提供引物序列(需要备注序列来源,不保证能检测),或者直接提供引物;

内参基因;对照组。

3、提供对照组为什么还需要提供内参?

很多客户都会有这样的疑惑,为什么我已经提供给你们对照组,为什么还要确定内参基因?

在QPCR中,需要加入内参基因校准正,消除不同样本在RNA产量、质量以及逆转录上可能存在的差别,从而获得目的基因特异性表达的真正差异。在Q的实验数据分析中计算的是相对表达量,是以客户指定的样品为标准进行相对定量数据分析,而客户指定的样品即为对照组。

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