抗体筛选.Y2H

抗体在细胞内的表达已成功用于消除蛋白质功能。这一发现表明，该技术应对疾病治疗和功能基因组学有影响，其中预测功能未知的蛋白质基因组序列。一个主要的障碍是一些抗体在真核细胞中不起作用，大概是因为抗体在细胞质中不正确地折叠。为了克服这个问题，我们已经开发了一种使用酵母双杂交体系用于筛选细胞内功能抗体的方法。我们发现几种特征抗体在真核细胞中以双杂交形式结合它们的靶抗原，我们已经能够从在体外结合抗原的scFv组中分离细胞内结合的物质。

抗体片段以scFv形式连接到 VP16 的转录激活域(AD)，靶抗原序列LexA DNA与结合域(DBD) 相连。如果抗体-抗原相互作用发生在体内，产生的复合物可以结合到上游的 LexA DBS（VP16 激活域因此被带到靠近 DNA 转录起始位点并且可以招募转录所需的辅助因子），从而激活HIS3基因或lacZ 基因产生β-gal使菌落呈现蓝色。最后，两个核定位信号位于 scFv-VP16 中，而诱饵抗原没有。因此，抗原和scFv之间的相互作用必须发生在细胞质，在复合物转移到细胞核之前激活转录。

图1：抗原-抗体相互作用

作为模型系统，使用了scFv片段 F8，识别AMCV的p41外壳蛋白

结果表明，scFvF8能够特异性地在细胞内与其相应的p41抗原相互作用

抗HIV整合酶scFvIN33来源于mAb并在人类细胞中表达，导致特异性中和HIV-1 整合酶活性，当HIV-1INyBTM116诱饵与scFvIN33yVP16融合表达在L40 酵母中，可以发现菌落呈现蓝色。

确定是否从噬菌体展示中选择的scFv体外文库可以在抗体-抗原双杂交试验中发挥作用，测试了三个噬菌体衍生的scFv片段（scFvV6C11/VP16、scFvG4G11/VP16和scFvG6G2/VP16）是否能与酪氨酸激酶Syk蛋白发生作用。

当 scFv 片段Y13融合到VP16激活域(scFvY13/VP16)并与K-ras一起在酵母细胞中表达与LexA 融合的蛋白 (K-ras/BTM116)，在20℃时，两者相互作用，而在30℃没有。

通过等离子共振，在 5 到 800 nM 的范围内总共 12 个不同的 scFv 中只有两个对K-ras 抗原，使细胞在 20°C 下生长。因此，显然不是所有的 scFv 片段都从噬菌体展示文库能够结合其抗原在细胞内表达。

 图3：scFv与酵母中靶抗原的细胞内相互作用

在酵母中，抗原和抗体可以发生相互作用，在哺乳动物中，抗原和抗体是否能相互作用  

测试了与 AMCVp41、HIV-1 结合的 scFv整合酶、K-ras 和 β -gal。与得到的结果相比在酵母中，只有后者激活 CAT 报告基因时与适当的诱饵共同表达（后者不能用于酵母，因为所需的 β-gal 诱饵不合适）这一发现表明 ScFv 与CHO 细胞中的 β-gal 抗原足以激活 CAT基因。 当 CHO 细胞与 CAT 报告基因共转染时pM-β-gal 诱饵和 pNLS-scFvR4-VP16 载体增加约 60 倍检测到 CAT 活性。此外，ScFvR4 与 GAL4 DNA 的融合结合域和 β-gal 与 VP16 激活域保留了激活 CAT 报告器的能力，尽管低约 50%（图 4a，7）。较低的效率可能是结构约束的结果，作为表达ScFvR4 连接在 VP16 激活域的 C 端还显示减少的CAT 激活（图 4a，10）。这两个独立实验的定量数据在图 4b 中。 

图 4：哺乳动物仓鼠卵巢 (CHO) 细胞抗体-抗原双杂交 CAT（氯霉素乙酰转移酶）测定

                                                                                                                                         1：pM-β-gal+pNLscFvR4-VP16       7：pM-scFvR4+pNLVP16-β-gal

2：仅pE5C-CAT报告基因              8：pM-scFvR4

  3：pM-β-gal                         9：pNLVP16-β-gal

                           4：pNLscFvR4-VP16                  10：pM-β-gal+pNLVP16-scFvR4

                5：pM-β-gal+pNLscFvF8-VP16       11：pNLVP16-scFvR4

                                                                                                                                          6：pNLscFv-VP16+pM1-AMCV

研究了酵母细胞中的 scFvF8与VP16 融合蛋白凝胶迁移率测定

scFvF8-VP16的迁移率在还原和非还原状态之间没有显示电泳迁移率的变化条件，表明它不会在酵母细胞质中形成二硫键（红色）。因此，酵母中制造的 scFvF8 似乎不会有 S-S 键，但确实保留了与抗原结合的能力。所以，我们认为 scFvF8 是一种理想的分子，在体内进行模型选择以显示酵母抗体-抗原系统应适用于抗体选择策略

图 5：scFv 片段的氧化还原状态

    scFvF8-VP16的蛋白质印迹分析（在 L40 酵母细胞的细胞质中表达）和分泌的scFv片段（scFvaD11，在昆虫细胞）。样品在含有SDS-PAGE上样缓冲液中制备(+β-mer)或(-β-mer) β-巯基乙醇。印迹后，scFv用抗myc抗体9E10检测片段。

将AMCVp41/BTM116 诱饵和50万分之一的scFvF8-VP16 的文库质粒转染酵母细胞，在组氨酸缺陷平板上分离菌落。3天后，从四十分之一的转染混合物中生长出84个菌落。这些被挑选出来并重新涂在一个网格板上（没有组氨酸），并筛选这些菌落的 β -gal 活性。在图 6a，显示了 48 个这些克隆的结果，其中22 呈现出强烈的蓝色，表明酵母含有与 AMCV 诱饵 DNA 结合的 scFvF8-VP16蛋白质。挑选10个蓝色较强的菌落测序发现都是scFvF8。

图6：从50万个scFv混合物中选择scFvF8-VP16克隆的模型克隆

此处描述的模型选择，使一个克隆能从五十万个不同的克隆中分离出来，证明了分离特异性 scFv 片段的可行性。因此这样的选择方法消除了对 抗体工程的需求，例如适应新的增加折叠稳定性的框架（例如，通过随机或定向诱变）。现有的 scFv 噬菌体展示文库可用于初步体外筛选，然后用于酵母中的体内筛选。 

如果将免疫小鼠脾脏 RNA 直接克隆将得到的scFv 导入酵母中进行体内筛选。这系统应该极大地促进候选抗体的识别对于细胞内抗体应用，应适合开发基于细胞的高通量功能基因组应用中的筛选程序。