毕赤酵母表达

研究背景

目前乙型肝炎病毒感染是全球性公共卫生问题,现有亿患者受其困扰。随着抗单克隆抗体和抗体片段的研究开发,发现能够和乙肝病毒表面特异性位点结合并封闭其侵袭肝细胞的活性,而融合了对病毒有较好临床治疗效果的干扰素的双功能抗体将能够起到导向性预防和治疗的双重作用。

本文在前期工作的基础上,将抗HBsAg单链抗体(single-chain Fv against HBsAg,HBscFv)基因与干扰素γ(IFNγ)基因在体外拼接成单一基因，然后转入巴氏毕赤酵母中分泌表达，并对表达产物进行了纯化及体外生物学话性和理化性质鉴定。

实验过程

体外基因及其表达载体的构建

首先是设计合适的引物并分别从含干扰素y基因的载体和含抗HBsAg单链抗体的质粒中PCR扩增出干扰素Y基因和HBscFv基因。接着成功采用重叠PCR技术，通过基因SOEing方法将两基因拼接成单一基因HBscFv-IFNγ，并进行序列测定，其结果表明，所获得的基因产物为正确的HBscFv-IFNγ基因。

将筛选到可能含重组质粒pPICZaA/(HBscFv-IFNγ)2的TOPI0菌株液体培养并提取质粒后。用0.8%的琼脂糖凝胶电泳观察判断是否为pPICZaA/(HBscFv-IFNγ)2,电泳结果如图2-11。

在P.pastoris中分泌表达融合蛋白HBscFv-IFNγ

将测序确认正确的酵母表达质粒pPICZaA/HBscFv-IFNY用酶PmeI线性化，同多拷贝表达载体pPICZaA/(HBScFv-IFNy)n=2、4、6一起，分别采用LiC1法或电穿孔转化法转化P.pastoris GS115或X33,获得大量转化子。

根据Elisa检测的结果和SDS-PAGE蛋白定量分析的结果，可以发现Elisa检测与SDS-PAGE之间存在近似线性的正向对应关系，即Elisa检测值高时则HBscFv-IFNγ的蛋白量多，Elisa检测值低时则HBscFv-IFNγ的蛋白量少。

对酵母表达IBscFv-IFNγ融合蛋白进行纯化和鉴定

酵母培养上清中的目的蛋白以60%饱和度硫酸铵分级沉淀，Con-Sepharose4B亲和层析柱纯化酵母表达的重组人源HBscFv-IFNγ融合蛋白，纯度可达70%~80%左右，但▣收率偏低，只有50~60%。采用鼠抗HBscFv单克隆抗体14F7亲和层析柱纯化酵母表达的重组人源性HBscFv-IFN￥融合蛋白，纯度可达90%~98%，回收率可提高到70~85%。ELISA实验测定结果表明酵母表达的重组人源抗HBsAg HBscFv-IFNγ融合蛋白与乙肝表面抗原有较强的亲和力。

对酵母表达HBscFv-IFNγ融合蛋白发酵工艺以及工艺参数的优化

转化菌株X3的生长与目的蛋白HBscFv-IFNγ的合成呈S型曲线，细胞合成及分泌表达HBscFv-IFNγ融合蛋白滞后于X3的生长，即主要在对数生长后期和平衡期表达。

结论

体外成功构建了HBscFv-IFWy基因、pPICZaA/HBscFv-IFNγ载体、以及相应的多拷贝载体pPICZaA/(HBscFv-IFNY)n=2,4,6:首次在巴斯德毕赤酵母中获得人源抗HBsAg HBscFv-IFNY融化蛋白的分泌表达；首次运用14F7单克隆抗体亲和层析技术纯化了HBscFv-IFNγ融化蛋白的研究。