导读

      蛋白质表达是指利用细菌、酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞或植物细胞表达外源基因蛋白质的一种分子生物学技术，是基因工程技术的重要组成部分之一。毕赤酵母表达系统因其低成本、高产量和一定的翻译后修饰而被越来越多的使用。

一、毕赤酵母表达系统特征

酵母表达系统包括酿酒酵母表达系统、甲醇酵母表达系统和其他酵母表达系统。毕赤酵母属于甲醇营养型酵母，可以利用甲醇作为唯一碳源。那么毕赤酵母表达系统有什么优势呢？我们总结了以下要点：

(1) 拥有目前调控机制严格的启动子之一，醇氧化酶基因的启动子AOX1，非常有利于外源基因的表达调控；

(2) 具有蛋白质翻译后的加工和修饰功能，如磷酸化、糖基化等。是不可多得的具有多重优势的真核表达系统；

(3) 在细胞内外都能表达；

(4) 培养基成本低，培养条件简单，生长繁殖速度快；

(5) 外源基因可以在特定位点以单拷贝或多拷贝的形式整合到酵母染色体中，并随染色体复制而复制，遗传稳定性高，像酿酒酵母一样作为稳定表达菌株存在；

(6) 可进行大规模发酵，适合高密度培养，非常适合重组真核蛋白的工业放大化生产制备。

二、毕赤酵母表达系统常用菌株类型

毕赤酵母宿主常用的菌株有四种(见表1)，即X33、GS115、KM71H和SMD116。X33是野生型菌株，而GS115和KM71H都具有HIS4营养缺陷型标记。GS115菌株有AOX1基因，属于Mut+，指甲醇利用正常型；KM71 H菌株的AOX1位点插入ARG4基因，属于Muts，指的是甲醇利用缓慢型。两种菌株都适用于一般的酵母转化方法。SMD116(his4 pep4)是一种蛋白酶缺陷型菌株，可以表达一些由于蛋白质降解导致的表达产物分布不均出现的问题。然而，SMD116(his4 pep4)菌株生长缓慢导致表达的外源蛋白产量低。

表1毕赤酵母宿主菌常用的四种菌株

三、毕赤酵母表达载体类型及特征

毕赤酵母表达载体主要是整合载体，常见的整合载体包括胞内蛋白表达和分泌蛋白表达。如果外源蛋白是细胞溶质型的无糖糖基化蛋白，则它适合于胞内表达。如果外源蛋白可以正常分泌，或者糖基化蛋白或者分泌到细胞内的细胞器中，那么就可以采用分泌表达。

毕赤酵母分泌表达载体主要有pPICZA(载体图谱见图1)、pPIC9K等。酿酒酵母分泌信号-α交配因子(α-factor)引导序列已成功用于引导几种外源蛋白的正确分泌。毕赤酵母的胞内表达载体主要有pPIC3K、pPICZA、pPIC3.5K等。目前平台提供表达毕赤酵母胞内蛋白表达的pPICZA载体，pPICZαA用于分泌蛋白的表达，所有载体均由AOX1启动子诱导。

图1： pPICZα A, B, C载体图谱

毕赤酵母表达载体含有醇氧化酶-1 (AOX1)基因的启动子和转录终止子，它们被可以插入外源基因的多克隆位点(MCS)分隔开。该载体还包含组氨酸脱氢酶基因(HIS4)选择标记和3’AOX1区。X3和GS115菌株的AOX1区或KM71H菌株的AOX1::ARG4区与载体pPICZ或pPICZ上两个AOX1区的AOX1启动子区和AOX1转录终止区(TT)具有单一交叉事件，并且一个或多个载体拷贝将被插入受体细菌的AOX1或AOX1 :: ARG4基因的上游或下游。X-33或GS115中转化子的表型为Mut+，KM71H中转化子的表型为MutS。通过线性化重组质粒AOX1的5’AOX1区，可以根据所用的受体细菌方便地产生Mut+或MutS重组转化子。图2显示了将重组质粒插入完整AOX1位点(Mut+)的结果，以及获得pAOX1基因和Zeocin抗性基因的结果，这也发生在非线性化载体和自连接载体中，但是频率低。

图2 外源基因插入AOX1或aox1::AGR4位点

四、毕赤酵母表达外源蛋白的方法步骤

毕赤酵母表达外源蛋白的基本操作流程如图3所示，详细步骤请看之后的内容

图3 毕赤酵母表达外源蛋白流程图

1、表达质粒线性化

使用Sac I（209bp）、PmeI(414bp)、BstX I(707bp) [3]三种内切酶中的一种酶（请确保插入的目的基因不含有此酶切位点）对表达质粒进行线性化酶切，这时内切酶会在表达载体pPICZ或者pPICZα的5’AOX1位点处进行酶切。通常酶切切体系为100μL(确保酶切的质粒大于5μg)，酶切完后跑电泳检验质粒是否被切开（参考图4a）

2、酚氯仿抽提质粒

（1）将酶切完后约100μL体系补至400μL；

（2）加入等体积的酚氯仿（酚氯仿取下层），混匀，4度静置10min；

（3）取上层水样，加入500μL预冷无水乙醇，置于—20度，1h，4度离心20min，去上清；

（4）加入250μL70%乙醇，4度，离心20min，去上清；

（5）吹干，加入20μLddH₂O。

3、酵母感受态的制备及电转

（1）将酵母菌划线后挑点（参考图4b），5mL YPD(大概能做10支)，27℃，220rpm，过夜；

（2）OD600=2.0（1.8-2.0，一般摇12h-18h之间不会长过，500g，4℃离心；

（3）加入2 mLddH₂O，500g离心，重复两次；

（4）加入0.5 mL 1M LiCl,0.5 mL 10*TE(100mM Tris 7.5,10mM EDTA),4 mLddH₂O,27℃,220rpm,摇1h；

（5）加入125μL DTT(1M)，27℃，220rpm,摇30min；

（6）500g离心，去上清，加2 mLddH₂O洗2次；

（7）加入1mL1M山梨醇，重悬，冰上静置5min；

（8）取100μL+linear DNA(大于5μg)进行电转，电转杯金属片对两电极，电转杯侧面突起向外，加入DNA后，需在冰上放置5min（电穿孔电击条件：电压：1500V，电阻：400Ω，电容：25μF，脉冲时间：10mS，一次电击）；

（9）加入1mL1M山梨醇，洗出至1.5 mLEP管中；

（10） 500g离心，去上清，加入1mLYPD，27℃，220rpm,摇3h；

（11） 500g离心，加入0.1mLYPD，涂zeocin抗性板；

（12） 置于27-30度培养箱培养2-3天后平板上会长出转化子（参考图4c）

图4 某次实验中质粒线性化及转化结果

4、转化子鉴定及试表达

（1）使用高抗性的板子筛选转化子，待YPD板上长出单菌落，挑取单菌落，在PCR管中涮一下，随后进行PCR菌落筛选验证（参考图5）根据结果，转接入含50mlBMGY的小三角瓶中，30℃，200rpm,培养至OD600=1-1.5；

（2）将小三角瓶中的培养体系转移入100ml离心管，3000g,5min收菌；

（3）沉淀用BMMY重悬至OD600=0.3（约100-200ml）；

（4）转移至500ml的大三角瓶中，30℃，200rpm开始诱导表达培养，间隔时间取出1ml速冻后保存于-80℃，并补充终浓度0.5%的甲醇，取样时间点：0h、12h、24h、48h、72h、96h；

（5）各个时间点取的样离心1min取上清,上清取30ul加10ul loading buffer煮10min,离心（13000rpm,5min），取15ul跑SDS-PAGE；

图5 某次实验中PCR screen 结果

5、蛋白提取

（1）将诱导表达到一定天数的毕赤酵母离心，假如目的蛋白是分泌表达我们就收取上清，可以使用浓缩包浓缩培养基将上清置换成裂解缓冲液。如果目的蛋白是胞内表达，我们就要将酵母细胞破碎，通过使用高压均质机可以将毕赤酵母细胞破碎（参考图6）

图6 某次实验中高压破碎结果

（2）可以通过亲和层析，离子交换层析以及分子筛层析等层析柱分离纯化目的蛋白，图7为利用毕赤酵母X33菌株表达一种嗜热蛋白酶时通过镍柱亲和层析，热处理，分子筛层析等方法将目的蛋白提纯。

图7 某次实验中分子筛及SDS-PAGE结果

五、结语

近年来毕赤酵母表达系统已经成功高效的表达了许多蛋白，降低了成本的同时又提高了表达量，例如a-淀粉酶，肿瘤坏死因子（TNF）等产量都能达到g/L的量级，是目前较为成功的外源蛋白表达系统之一。我们有理由相信毕赤酵母表达系统可以用于更多外源蛋白的表达，在生物医药，美容护肤等领域留下浓墨重彩的一笔。