过早衰老会降低作物的产量和质量。WRKY 转录因子 (TFs) 在叶片衰老过程中发挥重要作用，但对其在棉花中的衰老机制知之甚少。

2019年3月29日中国农业科学院棉花研究所在BMC Plant Biology上发表题为“The WRKY transcription factor GhWRKY27 coordinates the senescence regulatory pathway in upland cotton (Gossypium hirsutum L.) ”的学术论文，本文揭示了WRKY 转录因子GhWRKY27协调陆地棉 ( Gossypium hirsutum L.) 的衰老调控途径。

在这项研究中，分离并表征了第 III 组 WRKY TF，GhWRKY27。GhWRKY27的表达是由叶片衰老诱导的，并且在早熟棉花品种中的表达高于在非早熟棉花品种中的表达。GhWRKY27在拟南芥中的过表达促进了叶片衰老，这是由叶绿素含量降低和衰老相关基因 (SAG) 表达升高所决定的。

我们使用衰老棉叶构建了酵母双杂交 (Y2H) cDNA 文库，并使用GhWRKY27作为诱饵进行文库筛选以筛选其相互作用的伙伴。通过文库筛选，分离并测序了大约164个阳性菌落。丢弃重复序列后，鉴定了 67 个潜在的相互作用蛋白。功能注释分析表明，这些候选蛋白主要参与信号转导、应激反应和生长发育调控。

图 4在酵母细胞和拟南芥叶肉原生质体中测定了GhWRKY27与GhTT2、GhBTF3和GhRD21A的相互作用

为了确定哪些蛋白与GhWRKY27相互作用，我们选择了三个候选基因，MYB结构域蛋白基因TT2（Gh_A07G0140，GHT2），TF BTF3（Gh_A08G2018，GhBTF3）和半胱氨酸蛋白酶RD21a（Gh_D01G1044，GhRD21A），并使用Y2H系统进行了研究。将这三个基因的ORF克隆到pGADT7载体中。将每个融合构建物和pGBKT7-GhWRKY27质粒共转化到Y2H酵母菌株中。我们的结果表明，共转化酵母细胞含有阳性对照pGBKT7-p53 + pGADT7- largeT和实验组pGBKT7-GhWRKY27 + pGADT7-GhTT2在SD上生长良好/−Trp/−Leu/-他的中等身材，在SD上变为蓝色/−Trp/−Leu/−他的/−Ade/X-a-Gal/AbA培养基。然而，在实验中和酵母细胞的阴性对照pGBKT7 laminC+pGADT7- largeT中没有发现pGBKT7-GhWRKY27 +pGADT7-GhBTF3,pGBKT7-GhWRKY27 + pGADT7-GhRD21A和相互作用。

为了识别参与调控网络的下游靶基因，使用 Y1H 系统选择并验证了 8 个假定的靶基因。这些基因编码激素相关酶（GhIAA15A、Gh20ox2和GhGH3.5）、TFs（GhWRKY1）、成熟相关蛋白（GhRipen2-1和GhRipen2-2）、天冬氨酸蛋白酶（GhASPG1）和细胞色素P450（GhCYP94）。来自峰值序列的三个串联拷贝，代表启动子区域中最可能的结合位点，与 pHIS2 诱饵载体融合（附加文件 3：表 S3）。GhWRKY27被插入到 pGADT7 猎物载体中。猎物构建体与诱饵载体共转化到 Y187 酵母细胞中。结果表明，含有GhWRKY27与GhCYP94C1和GhRipen2-2特定启动子区域组合的转化产物在 SD/-Trp/-Leu + 200 mM 3-AT 选择培养基上生长良好，而阴性对照和其他候选基因没有（图 6a）。

图 6GhWRKY27直接靶向GhCYP94C1和GhRipen2-2的启动子

酵母双杂交 (Y2H) 和双分子荧光互补 (BiFC) 测定表明GhWRKY27与 MYB TF、GhTT2 相互作用。GhWRKY27 的推定靶基因通过染色质免疫沉淀和测序（ChIP-seq）鉴定。酵母单杂交 (Y1H) 测定和EMSA 显示GhWRKY27直接结合细胞色素 GhCYP94C1和 GhRipen2–2的启动子。此外，在叶片衰老期间鉴定了GhTT2、GhCYP94C1和GhRipen2-2的表达模式。瞬时双荧光素酶报告基因检测表明GhWRKY27可以激活GhCYP94C1和GhRipen2-2的表达。

总之，分离并表征了第 III 组 WRKY TF，GhWRKY27。不同衰老阶段棉花叶片的基因表达谱显示GhWRKY27受叶片衰老诱导，主要在早龄棉花品种中表达。GhWRKY27 的过表达加速了拟南芥叶片衰老，伴随着 SAG 转录物的积累增加。GhWRKY27显示与GhTT2相互作用并与GhCYP94C1和GhRipen2-2的启动子结合。GhTT2、GhCYP94C1和GhRipen2-2在叶片衰老的不同阶段差异表达。此外，GhWRKY27在叶片衰老过程中激活了GhCYP94C1和GhRipen2-2的转录表达。

我们的结果表明，GhWRKY27可能通过与其他基因的相互作用或转录调控来正向调节叶片衰老。这些发现为棉花叶片衰老的调控途径提供了新的见解，并为将短季棉花品种遗传改良为早熟非早熟棉花品种提供了理论基础。

文献链接：https://bmcplantbiol.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12870-019-1688-z