寄生生物可以针对性的改变寄主的某些生理过程，从而促进自身的定殖和毒力。大部分寄生生物只有一个寄主，但是也有相当一部分寄生生物需要多个寄主才能完成整个生命周期。这些寄生生物往往依赖不同寄主的互相取食，并且进化出了对应的机制，通过改变寄主的发育和行为从而增加自己在不同寄主间传播的机会。比如，吸虫可以导致寄主树蛙的身体畸形，从而增加树蛙被鸟类（吸虫的最终寄主）取食的机会【1】。植原体也是一种可以改变寄主生长发育的寄生生物，这类生物可以侵染大部分维管束植物并引起植物的形态变化，比如丛枝病和花序叶化【2】。同时，植原体具有多个寄主，不但能够寄生植物，同时也能寄生昆虫。植原体通过昆虫在不同植物上取食从而在不同植物中传播。植原体-昆虫-植物三者的互作是我们理解和研究多寄主专性寄生生物的绝佳系统。

近期的研究发现了一些可以侵染模式植物拟南芥的植原体从而大大加快了植原体致病机制的研究进程【3】，其中之一就是AYP植原体（Aster Yellows phytoplasma）。它的主要昆虫寄主是杂食性的叶蝉。AYP可以导致丛枝病和花序叶化的症状，严重时可以导致整片农田颗粒无收。研究表明，植原体主要通过分泌效应因子造成丛枝和花叶化等现象【4】，这些效应因子可以从韧皮部扩散到其他相邻的植物组织，比如茎和顶端分生组织。对AYP基因组的分析鉴定到了56个候选效应因子（SAP， secreted AY-WB proteins），但目前只有很小一部分效应因子得到了功能解析。比如SAP11可以靶标并促进拟南芥TCP转录因子的降解，从而导致叶片形状改变和茎增殖现象【5】。但是，目前已知的植原体效应因子功能无法完全解释植原体导致的病症，如生长周期增长和丛枝病等症状。

近日，挪威约翰英纳斯中心Saskia A. Hogenhout课题组在Cell上发表题为Parasitic modulation of host development by ubiquitin-independent protein degradation的学术论文，本文发现了植原体效应因子SAP05可以靶标和降解两个不同的转录因子家族，SPL家族和GATA家族，从而导致植物生长周期增长和丛枝病等症状。SAP05通过与26S泛素受体RPN10结合介导非泛素依赖的降解。有趣的是，SAP05不与昆虫寄主的RPN10结合。以此为线索，作者将拟南芥RPN10的两个位点突变，抑制SAP05与拟南芥RPN10的结合从而提高了拟南芥对植原体的抗性。

结果

（1）SAP05影响植物形态和生殖

为了鉴定能够引起丛枝病和症状的效应因子，作者对植原体的56个效应因子进行了拟南芥转基因，并对表型进行了筛选。其中SAP05可以导致拟南芥生长出更多的叶子，并且叶缘没有锯齿（图1A）。同时，SAP05转基因拟南芥茎分支增多，花序叶化并表现出矮小症状（图1B-D）。由于自然情况下，植原体效应因子被分泌到韧皮部细胞中，作者同时也用韧皮部特异表达的启动子控制SAP05做了拟南芥转基因，发现其表型与35S启动子表型一致（图1I）。

图1 SAP05影响植物形态和生殖

（2）SAP05通过泛素受体RPN10促进SPL和GATA转录因子的降解

为了探究SAP05的靶标，作者进行了酵母双杂交筛库实验，结果表明SAP05与GATA和SPL家族转录因子互作（图2A，B）。为了进一步验证SAP05与这两个转录因子家族互作，作者进一步使用了一个包含78.5%拟南芥转录因子的库进行酵母筛库实验。发现SAP05与22个转录因子互作，其中包含了6个SPL和7个GATA。通过截短酵母双杂实验，作者发现GATA和SPL家族转录因子的锌指结构域就足够与SAP05发生互作（图2C）。同时作者也发现拟南芥26S蛋白酶体亚基RPN10也与SAP05互作。RPN10位于26S蛋白酶体的19S调节粒子中，是主要的泛素受体，通过招募泛素化的蛋白从而对其进行降解。截短实验表明SAP05与RPN10的N端互作（图2D）。

由于SAP05与26S蛋白酶体亚基互作，作者想要探究是否SAP05可以促进GATA和SPL转录因子的降解。利用原生质体转化实验，作者发现表达SAP05可以显著的抑制GATA和SPL转录因子的积累（图2E）。为了探究SAP05对SPL和GATA的降解是否依赖RPN10，作者使用了rpn10突变体。在突变体中SAP05无法降解GATA和SPL，而回补RPN10后则可以降解，说明了SAP的降解功能依赖于RPN10（图2F）。同时，作者利用SPL-GUS转基因植株验证了在植原体侵染过程中，SPL确实会被降解（图2G-H）。

图2 SAP05通过泛素受体RPN10促进SPL和GATA转录因子的降解

（3）SAP05将转录因子招募至RPN10从而在26S蛋白酶体中被降解

RPN10被报道参与26S蛋白酶体的降解和自噬过程。为了探究哪个过程介导了转录因子的降解，作者使用了蛋白酶体抑制剂和自噬抑制剂。结果表明，只有蛋白酶体抑制剂可以抑制SAP05的降解（图3A，B）。

下面，通过gel filtration实验和Pull-down实验，作者证明了SAP05，RPN10和转录因子可以形成三聚体，并且三聚体的形成依赖于SAP05（图3C-E）。接着，由于降解依赖26S蛋白酶体，作者想要探究是否泛素化对转录因子的降解是必须的。作者将GATA转录因子可能的泛素化位点（赖氨酸）全部突变，发现突变体仍然能够被SAP05降解（图3F）。同时，过表达Ub△GG（一个显性抑制的泛素，能够抑制蛋白的泛素化）也不能够抑制SAP05的降解（图3G）。最后，作者纯化了人的26S蛋白酶体，发现只有在RPN10存在的情况下，SAP05才可以利用人的26S蛋白酶体降解转录因子（图3H）。这些结果表明SAP05通过将转录因子与RPN10链接形成三聚体并促进转录因子降解，而这个过程是非泛素依赖的（图3I）。

图3 SAP05将转录因子招募至RPN10从而在26S蛋白酶体中被降解

（4）SAP05同时破坏SPL和GATA的稳态，导致植物发育变化

作者从7个植原体小种中鉴定了SAP05的同源蛋白，发现每个小种含有1-2个同源蛋白。大部分SAP05同源蛋白可以同时与SPL和GATA互作，也有部分只能与其中一种互作（图4A-B），并且SAP同源蛋白不能降解与其不互作的转录因子（图4C，D）。对这些SAP05同源基因进行转基因后发现，单纯结合SPL或GATA转录因子的基因不能够完全再现丛枝病的症状（图4E-H），这表明SAP05是通过同时破坏SPL和GATA稳态导致了丛枝病的发生。

图4 SAP05同时破坏SPL和GATA的稳态，导致植物发育变化

（5）昆虫导向的拟南芥RPN10基因编辑增加了植物对植原体的抗性

昆虫编码GATA转录因子和RPN10但不编码SPL。作者利用酵母双杂交实验证明了SAP05不与昆虫GATA转录因子互作。同时，昆虫的RPN10和拟南芥的RPN10同源性很高（图5A），作者进一步验证了是否昆虫的RPN10与SAP05互作，结果表明不互作（图5B）。对昆虫和拟南芥RPN10的蛋白序列进行分析后发现主要有两处不一致，酵母双杂交实验和降解实验进一步证明是第一处不一致导致了不同的互作结果（图5B,C）。作者进一步对拟南芥RPN10相应的地方进行了突变，发现突变后RPN10与SAP05的互作强度显著减弱。同时，利用RPN10突变体进行转基因，发现转基因植株增强了对植原体的抗性（图5D-J）。

图5 昆虫导向的拟南芥RPN10基因编辑增加了植物对植原体的抗性

总结

本文首次鉴定到了能独立介导植物丛枝病的效应因子SAP05。通过对此植原体效应因子的作用机理研究，该研究阐明了‘丛枝’这一现象产生的分子机理。发现了SPL和GATA转录因子在植物生长和发育过程中的重要作用，并被植原体靶标从而诱导丛枝病。同时，作者发现了一条不依赖于泛素化的26S蛋白酶体降解途径，加深了我们对26S蛋白酶体的理解。最后，作者利用昆虫导向的基因编辑，研发出了抗植原体的植株，进而为农作物生长的精细调控，靶向蛋白降解和虫媒微生物的防治提供了新的思路。

参考文献

1. Al-Subhi, A.M., Al-Sadi, A.M., Al-Yahyai, R., Chen, Y., Mathers, T., Orlovskis, Z., Moro, G., Mugford, S., Al-Hashmi, K., and Hogenhout, S. (2020). Witches’ broom disease of lime contributes to phytoplasma epidemics and attracts insect vectors. Plant Dis. Published online December 21, 2021. https://doi.org/10.1094/PDIS-10-20-2112-RE.

2. Arashida, R., Kakizawa, S., Ishii, Y., Hoshi, A., Jung, H.Y., Kagiwada, S., Yamaji, Y., Oshima, K., and Namba, S. (2008). Cloning and characterization of the antigenic membrane protein (Amp) gene and in situ detection of Amp from malformed flowers infected with Japanese hydrangea phyllody phytoplasma. Phytopathology 98, 769–775.

3. Bai, X., Zhang, J., Ewing, A., Miller, S.A., Jancso Radek, A., Shevchenko, D.V., Tsukerman, K., Walunas, T., Lapidus, A., Campbell, J.W., and Hogenhout, S.A. (2006). Living with genome instability: the adaptation of phytoplasmas to diverse environments of their insect and plant hosts. J. Bacteriol. 188, 3682–3696.

4. AYu, A., Swaminathan, S., Krantz, B.A., Wilkinson, K.D., and Hochstrasser, M. (1997). In vivo disassembly of free polyubiquitin chains by yeast Ubp14 modulates rates of protein degradation by the proteasome. EMBO J. 16, 4826–4838.

5. Chang, S.H., Tan, C.M., Wu, C.T., Lin, T.H., Jiang, S.Y., Liu, R.C., Tsai, M.C., Su, L.W., and Yang, J.Y. (2018). Alterations of plant architecture and phase transition by the phytoplasma virulence factor SAP11. J. Exp. Bot. 69, 5389–5401.

原文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867421010126