小G蛋白（Small GTPases）是一类分子量20-40Kda的单体蛋白，在植物中可以被分为Rho，Rab，Arf和Ran五个亚家族【1】。小G蛋白具有静息型和激活型两种状态，与GDP结合时为静息型，而发挥功能时往往与GTP结合激活下游反应。大量的研究表明RHO蛋白可以作为一种“分子开关”调控包括细胞增殖，细胞骨架组织/重排，花粉管伸长和植物激素响应等重要的生理过程【2】。同时，RHO类蛋白也被报道参与植物免疫：比如水稻中的OsRCA4和OsRAC5负调控水稻对稻瘟菌的抗性【3】；大麦中的CA-HvRACB负调控大麦对白粉菌的抗性【4】。但是RHO类蛋白在植物对病毒免疫中的作用还是未知的。

WRKY类转录因子因其成员都在氮端有一个保守的“WRKYGQK”七肽而得名，其家族成员广泛的参与植物免疫【5】。WRKY转录因子可以结合顺式结合元件“W-box”从而调控下游抗病相关基因的表达。尽管目前对WRKY转录因子的研究已经很多，但是对WRKY转录因子发挥功能的辅助因子还知之甚少。

近日，四川大学席德慧课题组在Journal of Experimental Botany上发表题为The small GTPase NtRHO1 negatively regulates tobacco defense response to Tobacco mosaic virus by interacting with NtWRKY50的学术论文，本文发现了普通烟NtRHO1可以与NtWRKY50互作并负调控烟草对花叶病毒的抗性。

（1）NtRHO1负调控对花叶病毒的抗性

通过转录组数据分析，作者发现了一个基因NtRHO1受花叶病毒诱导（图一）。NtRHO1长594个碱基，蛋白序列上具有5个保守的RHO蛋白结构。烟草瞬时表达实验表明，NtRHO1定位于细胞核与细胞质（图一）。通过转基因过表达和沉默，作者进一步证明NtRHO1负调控烟草对花叶病毒的抗性。

图一 NtRHO1的特征与定位

（2）酵母双杂交筛库鉴定WRKY50是RHO1的互作蛋白

为了探究NtRHO1负调控免疫的机制，作者首先对PR1等抗病相关基因进行了定量检测。发现NtRHO1可以负调控PR1的表达。PR1基因的启动子上富含WRKY转录因子识别的W-box，并且大量文献报道WRKY激活PR1的转录。作者猜测NtRHO1可能与WRKY转录因子在蛋白水平上互作，并发挥功能。通过酵母双杂交筛库技术，作者成功的鉴定到了WRKY50是RHO1的互作蛋白（图二）。并通过双荧光互补技术，Co-IP技术和Pull-down技术验证了WRKY50与RHO1的互作（图二）。

图二 WRKY5与RHO1互作

（3）酵母单杂表明WRKY50与PR1启动子结合

通过过表达和沉默技术，作者证明了WRKY50正调控植物对花叶病的免疫。为了探究WRKY50促进免疫的机制，作者对PR1进行了定量PCR实验。结果表明WRKY50可以促进PR1的表达。进一步作者通过酵母单杂交实验，确认了WRKY50可以与PR1启动子互作（图三）。利用EMSA实验，作者进一步验证了WRKY50与PR1启动子的W-box结合。

图三 WRKY50与PR1启动子结合

（4）NtRHO1抑制WRKY50与PR1启动子的结合活性

RHO1负调控PR1的表达且负调控植物免疫，而WRKY50促进PR1表达且正调控植物免疫，作者由此推测RHO1可以影响WRKY50与PR1启动子的结合。通过双荧光素酶报告实验，作者发现与RHO1共表达时，WRKY50诱导的PR1上调表达减弱。表明RHO1影响了WRKY50与PR1启动子的互作（图四）。

图四 NtRHO1抑制WRKY50与PR1启动子的结合活性

总结

本文通过对转录组的分析鉴定到了一个调控烟草对花叶病毒免疫的新基因NtRHO1，并发现NtRHO1可以抑制PR1的表达。通过酵母双杂交技术，作者发现了RHO1的互作蛋白WRKY50。通过酵母单杂交技术和双荧光素酶报告系统，作者证实了RHO1通过抑制WRKY50与PR1启动子结合从而抑制植物免疫。本文利用多个实验技术，将RHO1调控病毒抗性的机制解析的比较完整。

参考文献

1. Reiner DJ, Lundquist EA. 2018. Small GTPases. WormBook 16, 1-65 

2. Zhang Y, Xiong Y, Liu R, Xue HW, Yang ZB. 2019. The Rho-family GTPase OsRac1 controls rice grain size and yield by regulating cell division. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 116, 16121-16126.

3. Liu JL, Park CH, He F, et al. 2015. The RhoGAP SPIN6 associates with SPL11 and OsRac1 and negatively regulates programmed cell death and innate immunity in rice. PLOS Pathogens 11(2):e1004629.

4. Huesmann C, Reiner T, Hoeflfle C, Preuss J, Jurca ME, Domoki M. 2012. Barley ROP binding kinase1 is involved in microtubule organization and in basal penetration resistance to the barley powdery mildew fungus. Plant Physiology 159, 311-320. 5. Rushton DL, Tripathi P, Rabara RC, et al. 2012. WRKY transcription factors: key components in abscisic acid signalling. Plant Biotechnology Journal 10, 2-11

原文链接：https://academic.oup.com/jxb/advance-article/doi/10.1093/jxb/erab408/6364809