木瓜的成熟是一个与类胡萝卜素积累、果肉颜色和风味变化有关的生理和代谢过程，这取决于基因型和外部因素，如光和激素。在木瓜果实成熟过程中，尚未分析调控类胡萝卜素生物合成的转录因子。

福建农林大学研究团队在Horticulture Research 发表了一篇名为“Papaya CpbHLH1/2 regulate carotenoid biosynthesis-related genes during papaya fruit ripening”的文章揭示了木瓜CpbHLH1/2在木瓜果实成熟过程中调控类胡萝卜素生物合成相关基因。

RNA-Seq 实验是使用来自两个木瓜品种的木瓜果实的不同成熟阶段进行的。顺式作用元件番茄红素β环化酶基因（CPCYC-B和CpLCY-B ）被确定，并且随后的全基因组分析来鉴定结合这些顺式作用元件转录因子，鉴定CpbHLH1和CpbHLH2, 两个 bHLH 基因。CpbHLH1/2的表达在果实发育过程中发生改变，伴随类胡萝卜素生物合成相关基因CpCYC-B、CpLCY-B、CpPDS2、CpZDS、CpLCY-E和CpCHY-B 的转录增加。

图4：在木瓜成熟过程中显示了推定转录因子的结合位点和表达模式

鉴于 8 个 TF 的表达模式，可以合理地假设它们可以调节CpCYC-B和CpLCY-B的表达。为了测试这些 TF 是否可以与CpCYC-B / CpLCY-B的启动子结合，进行了酵母单杂交 (Y1H) 实验。酵母细胞与pGADT7- CpbHLH1  +  CpCYC-B 190bp 启动子、pGADT7- CpbHLH1  +  CpCYC-B 190bp 启动子突变体、pGADT7- CpbHLH1  + 目标重复元件 pGADT7- bHLH1共转化 + 重复靶突变元件、阳性对照和阴性对照将在缺乏 Leu 和 Trp 元件的基础 SD 培养基上培养（图5c）。然而，与阳性对照、pGADT7-bHLH1 + CpCYC-B190bp 启动子、pGADT7- bHLH1  + 靶元件重复共转化的酵母细胞可以在三重缺失基本培养基上生长。这些结果类似于酵母细胞共转化与pGADT7- bHLH2  +  CPCYC-B启动子，pGADT7- bHLH2  +  CpLCY-B启动子，pGADT7- bHLH1  +  CPCYC-B启动子。这些结果表明CpbHLH1/2可以与CpCYC-B 中的CANNTG 基序结合，并且酵母细胞中的CpLCY-B启动子（图5）。然而，其他六种 TF未能与CpCYC-B / CpLCY-B 的启动子一起作用。我们还初步证明了CpbHLH1/2可以通过 Y1H 与CpZDS、CpLCY-E和CpCHY-B启动子中的CANNTG 基序结合，但不能与CpPDS的启动子结合。因此，CpbHLH1/2和CpZDS、CpLCY-E、CpCHY-B之间存在CpCYC-B和CpLCY-B共表达模式。同时，酵母双杂交体在CpbHLH1和CpbHLH2之间没有相互作用。

图5：酵母单杂交验证CpbHLH1/2和CpCYC-B / CpLCY-B之间的相互作用

酵母单杂交体（Y1H）和瞬时表达试验表明CpbHLH1/2可以与CpCYC-B和CpLCY-B的启动子结合，并调节它们的转录。响应强光，类胡萝卜素生物合成相关基因表达升高和CpbHLH1/2表达改变的结果表明，CpbHLH1/2参与调节类胡萝卜素生物合成途径中关键基因的光介导机制。

总的来说，我们的研究结果证明了几个 TF 家族成员参与了类胡萝卜素基因的调控，并证明了CpbHLH1和CpbHLH2分别调控了番茄红素β-环化酶基因（CpCYC-B和CpLCY-B）的转录。这项研究对木瓜果实成熟过程中类胡萝卜素生物合成的调控机制有了新的发现。

文献链接：https://www.nature.com/articles/s41438-019-0162-2