毕赤酵母表达系统表达的蛋白一般都具有蛋白活性，而且具有高密度发酵、原料成本低廉、基因遗传稳定性高、表达效率高等特点，最关键的是可以实现分泌表达和翻译后加工修饰，目前该系统已经得到了大量推广和应用。

关键词：Secretory expression of Pichia Pastoris毕赤酵母外源基因分泌表达系统；

实验材料：P. pastoris GS115 strains，pPIC9K载体

研究路线及结果展示

本研究拟通过在毕赤酵母中表达DmAChE-like来证明DmAChE-like的AChE活性，并比较其与DmAChE的差异。课题组进行了农药敏感性实验，比较DmAChE类和DmAChE对杀虫剂的敏感性和选择性，为有机磷农药的常规监测提供新的酶源。

1、重组表达载体的菌落PCR阳性鉴定和转化及G418抗压筛选

本研究从pUC57-DmAChE-like质粒中扩增出一个237 bp的DmAChE-like基因片段(图2a)。将DmAChE-like克隆到表达载体pPIC9K中，菌落PCR结果如图2b所示。测序结果表明，重组质粒pPIC9K-DmAChE-like成功构建。电转的结果如图3所示。这些结果表明，随着G418浓度的逐渐升高，转化子的数量逐渐减少。在G418平板上选择单个菌株，使用通用引物(5'-AOX和3'-AOX)进行PCR，获得GS115 -pPIC9K - DmAChE-like阳性转化子。如图2c所示，出现了一条718 bp的条带(通用引物PCR得到的条带预期大小为718 bp，表明构建的载体已整合到P. pastoris GS115的基因组中)。

2、重组蛋白的表达及酶活性研究

重组表达菌株GS115-pPIC9K-DmAChE-like在甲醇中诱导表达，进行SDS-PAGE蛋白定性分析显示在4.3 kDa处有重组蛋白条带出现，如图所示。 

用Ellman法检测发酵上清的酶活性，由图6所示的时间曲线可知，DmAChE-like的酶活性随着发酵时间的延长而逐渐升高，在96h时开始趋于稳定。这说明DmAChE-like确实具有AChE活性，其水平与DmAChE酶活性相差不大。

3、农药敏感性比较

为了研究DmAChE-like对有机磷农药的敏感性，课题组比较了DmAChE和DmAChE-like对5种有机磷农药的敏感性。酶活性测定和抑制分析如实验部分所述。如图9所示，在1.0 mg/mL农药作用下，DmAChE-like较DmAChE更易被抑制。

研究结论

本研究选择的酵母表达系统是真核表达系统，具有繁殖快、营养需求简单、易于工业化大规模发酵生产的优点。此外，它还能对蛋白质进行多种翻译后修饰，以帮助维持生物制品的活性和稳定性。

本课题通过密码子对原序列进行优化，构建重组表达载体实现其在毕赤酵母中的高效分泌表达，并对两者不同来源的酶做农药致敏性实验分析，从而得出适用于农药快速检测方法且适用于工业化大规模生产的乙酰胆碱酯酶的优选酶源。 

本研究由国家发展改革委员会基金资助项目(No. 20111158)赞助