Myc 样碱性螺旋-环-螺旋转录因子 (bHLH TFs) 的 N 端包含一个相互作用域，即 MYB 相互作用区 (MIR)，它与R2R3-MYB 蛋白相互作用以调节参与花青素的基因生物合成途径。然而，尚未完全了解 MIR 域 bHLH 在该途径中的功能。

2021年3 月16日西北农林科技大学研究团队在InternationalJournal of Molecular Sciences发表了一篇名为“The MIR-Domain of PbbHLH2 Is Involved in Regulation of the Anthocyanin Biosynthetic Pathway in ”Red Zaosu” Pear Fruit”的文章揭示了PbbHLH2的MIR结构域参与调控“红枣”梨果实中的花青素生物合成途径。

1.1PbbHLH2基因是梨果皮中花青素生物合成途径的重要组成部分

为进一步验证PbbHLH2基因在花青素生物合成途径中的生物学功能，采用病毒诱导基因沉默（VIGS）系统对“Palcer”梨果实果皮中的PbbHLH2基因进行沉默。瞬时测定法表明，PbbHLH -TRV幼果果皮未恢复的喷射孔周围的红色色素沉着。PbbHLH- TRV果实果皮中的花青素浓度显着降低。此外，表达水平PbDFR，PbANS和PbUFGT基因以及那些PbMYB9，10和10b与空载体相比有所降低。此外，表达水平PbGSTF12在PbbHLH -TRV幼果剥离下降。因此，PbbHLH2基因似乎在梨果实的花青素生物合成途径中起重要作用。

图 3. PbbHLH2 (PbbHLH2 -OE) 瞬时过量表达的梨果实果皮中的花青素模式

1.2PbbHLH2 通过MIR 域与 PbMYB9、PbMYB10 和 PbMYB10b 相互作用

为了确定 PbbHLH2 是否与 PbMYBs 相互作用，使用洋葱表皮细胞进行了双分子荧光互补 (BiFC) 分析。PbbHLH2 蛋白与洋葱表皮细胞核中的 PbMYB9、10 和 10b 蛋白相互作用。然而，当PbbHLH2-△NE，具有缺失的MIR结构域和PbMYBs共渗入洋葱表皮细胞时，没有检测到荧光。这些结果表明 PbbHLH2 的 MIR 域对于与 PbMYB9、10 和 10b 的相互作用至关重要。

图 5. PbbHLH2 和 PbMYBs 在洋葱表皮细胞中的相互作用

1.3. PbbHLH2可激活梨果皮中PbANS、PbDFR和PbUFGT的启动子

为了研究PbbHLH2基因是否与梨中PbANS、PbDFR和PbUFGT基因的启动子区域结合，进行了酵母单杂交试验 (Y1H)。结果表明PbbHLH2直接结合PbDFR基因的启动子。当渗入到本塞姆氏烟草叶，PbbHLH2基因激活PbDFR启动子而不是PbANS启动子。当PbbHLH2是共同渗透与PbMYB10，启动子PbDFR被显着激活。当用PbMYB9渗入本氏烟草叶片时，PbbHLH2基因可以激活PbANS和PbUFGT启动子。因此，当PbbHLH2与PbMYBs共同渗透时，PbDFR、PbANS和PbUFGT上调。

图6. PbbHLH2相互作用与PbMYBs激活PbDFR和PbUFGT

在这项研究中，鉴定了含有 MIR 结构域的 PbbHLH2 并研究了其功能。PbbHLH2的过表达“红枣”梨皮中花青素含量增加，生物合成晚期基因表达水平升高。双分子荧光互补显示 PbbHLH2 与洋葱表皮细胞中的 R2R3-MYB TF PbMYB9、10 和 10b 相互作用，并证实 MIR 结构域在 MIR 结构域 bHLH 和 R2R3-MYB TF 之间的相互作用中起重要作用。此外，在酵母单杂交 (Y1H) 和双荧光素酶检测中，PbbHLH2 结合并激活了二氢黄酮醇还原酶启动子。综上所述，这些结果表明 PbbHLH2 的 MIR 结构域调节了梨果皮中的花青素生物合成。基于我们的结果，提出了描述 MIR 域PbbHLH2在花青素生物合成途径中的功能的工作模型。 

图 7. PbbHLH2 物理相互作用的拟议模型

文献链接：https://doi.org/10.3390/ijms22063026