WRKY 转录因子 (TFs) 在植物对叶片衰老和非生物胁迫的反应中起重要作用。然而，与棉花 叶片衰老和胁迫耐受相关的 WRKY TFs仍然很大程度上未知。

中国科学院研究团队在frontiers in plant science发表了一篇名为“The Cotton GhWRKY91 Transcription Factor Mediates Leaf Senescence and Responses to Drought Stress in Transgenic Arabidopsis thaliana”的文章揭示了棉花 GhWRKY91 转录因子介导转基因拟南芥叶片衰老和干旱胁迫响应。

在该研究中，分离并彻底表征了 WRKY 基因GhWRKY91。转录活性测定表明 GhWRKY91 可以激活酵母中的转录。评估了叶片衰老期间GhWRKY91的表达模式，以及对脱落酸 (ABA) 和干旱胁迫的响应。

1.1转基因拟南芥植物中GhWRKY91 的过表达延迟叶片衰老

为了评估GhWRKY91基因对植物的影响，我们在拟南芥植物中过表达GhWRKY91。产生了含有具有 35S:: GhWRKY91 的T-DNA 的转基因品系（图 5A）并通过 PCR和 qRT-PCR（图 5B）确认。21 天龄的转基因植物比 WT 植物的尺寸相对较小。与 WT 植物相比，35 天龄的转基因拟南芥植物表现出延迟开花和叶片衰老。当植株长到 50 天时，WT 植株严重衰老和变黄，而转基因植株仍然是绿色，只有少量变黄（图 5C）。此外，我们评估了 50 天龄植物叶片衰老过程中作为上调因子的 SAG 的转录水平。结果表明，转录物水平的脱镁叶绿素脱氢酶（AtPPH）)在转基因植物中显着低于在 WT 植物中（图 5D-J）。然而，野生型和转基因植物之间的非黄色着色的转录水平没有差异（图 5K）。

图5GhWRKY91的过表达在拟南芥属植物中延迟的叶子衰老

1.2GhWRKY91 直接结合GhWRKY17 和反式激活GhWRKY17表达的启动子

以往的研究表明，GhWRKY3、GhWRKY17 、GhWRKY25、GhWRKY27a 和GhWRKY68 通过介导 ROS 产生和 ABA 信号传导参与调节盐、干旱和 ABA 反应。APX基因编码的ROS清除酶催化过氧化氢的还原，和RD22参与的干旱耐受性。为了确定 GhWRKY91 的调控机制，我们预测了这些基因启动子中的 W-box，发现它们的启动子存在 W-box，表明这些基因作为靶标的潜在作用。在Y1H系统，包含GhWRKY91和特殊片段的启动子区域的转化产物GhWRKY17上生长良好，TDO + 200mM的3-AT选择性培养基，而其他的不仅生长或显示缺陷斑点（图7A）。

对于 EMSA 分析，基因（GhWRKY17、GhWRKY27a、GhWRKY68和GhAPX1）的 ATG 起始位点上游区域中的探针和序列位置显示在图 7B 中。仅包含生物素标记探针的泳道用作阴性对照（图 7C；泳道 1、4、6 和 8）。来自GhWRKY27a、GhWRKY68或GhAPX1基因的探针均未与 GhWRKY91 蛋白结合以产生延迟条带（图 7C；泳道5、7、9 ）。然而，GhWRKY17的标记探针可以被 GhWRKY91 蛋白识别并结合，从而导致迁移率变化（图 7C；泳道 2）。在这些情况下，大部分由GhWRKY91蛋白结合的标记的野生探针的竞争性均通过未标记的野生探针置换，导致带的消失（图7C ;泳道3），表明GhWRKY91可以结合的启动子GhWRKY17。

为了阐明 GhWRKY91 在GhWRKY17表达调控中的关系，在烟草中进行了瞬时双荧光素酶测定。对照数据（pGreenII 62-SK空载体pus GhWRKY17启动子）设为1，实验组数据为与对照组的比值。结果，如图7D所示，实验组的LUC/REN比值显着增加，是对照组的4.61倍。

图7GhWRKY91直接靶向的启动子GhWRKY17和反式激活GhWRKY17表达 

图 8 GhWRKY91 调控机制模型

在该研究中，分离并彻底表征了 WRKY 基因GhWRKY91。转录活性测定表明 GhWRKY91 可以激活酵母中的转录。评估了叶片衰老期间GhWRKY91的表达模式，以及对脱落酸 (ABA) 和干旱胁迫的响应。转基因拟南芥中由GhWRKY91启动子驱动的 β-葡萄糖醛酸酶 (GUS) 活性暴露于 ABA 和干旱处理后减少。GhWRKY91在拟南芥中的组成型表达延迟了自然叶片衰老。GhWRKY91转基因植物表现出增加的耐旱性和延迟干旱诱导的叶片衰老，伴随着胁迫相关基因的增强表达和衰老相关基因 (SAGs) 的减弱表达。酵母单杂交 (Y1H) 分析和电泳迁移率变化分析 (EMSA) 显示 GhWRKY91 直接靶向GhWRKY17，这是一种与 ABA 信号和活性氧 (ROS) 产生相关的基因。瞬态双荧光素酶报告测定证实GhWRKY91活化的表达GhWRKY17. 我们的研究结果表明 GhWRKY91 可能负调节自然和胁迫诱导的叶片衰老，并为进一步研究棉花叶片衰老和胁迫响应的功能提供基础。

文献链接：https://doi.org/10.3389/fpls.2019.01352