木质素是树干木质部细胞壁的主要成分之一。大多数开花植物（双子叶被子植物）木材中的木质素通常由三种单木质醇前体（松柏醇、芥子醇和对香豆醇）聚合而成，分别生成愈创木酚 (G)、丁香基 (S) 和羟基苯基(H)亚基。

中国林业科学研究院研究团队在frontiers inplant science发表了一篇名为“BEL1-likeHomeodomain Protein BLH6a Is a Negative Regulator of CAl5H2 inSinapyl Alcohol Monolignol Biosynthesis in Poplar”的文章揭示了BEL1样同源域蛋白 BLH6a 是杨树芥子醇单木质醇生物合成中CA15H2的负调节因子。

在这项研究中，我们专注于针叶树醛5-羟化酶 ( CAld5H2 ) 基因的转录调控，该基因编码芥子醇生物合成的关键酶。我们进行了酵母单杂交 (Y1H) 筛选，以确定调节CAld5H2 的候选上游转录因子 (TF) 。我们获得了 12 个上游 TF 作为CAld5H2 的潜在调节剂。其中一个 TF 基因 BLH6a 编码 BEL1样同源域 (BLH) 蛋白并负调节CAld5H2启动子活性。BLH6a对CAld5H2启动子的直接调节得到染色质免疫沉淀-定量聚合酶链反应 (ChIP-qPCR) 和转基因植物中 BLH6a 的显性抑制的支持。荧光素酶互补成像分析显示这 12 个 TF 之间存在广泛的蛋白质-蛋白质相互作用。我们提出 BLH6a 是 CAld5H2 的负调节因子，它通过对杨树中芥子醇生物合成的多个 TF 的组合调节起作用。

为了确定这 12 个 TF 中有多少 TF 可以与单木质素途径基因启动子中的CAld5H2启动子相互作用，我们进行了 Y1H 分析，以将这 12 个 TF 与从毛果松子中分离的其他单木质素途径基因启动子进行比较，在这 12 个 TF 中，只有 BLH6a 和 BLH6b  的同源物特异性结合CAld5H2启动子。BLH2  结合CAld5H2和CAld5H1启动子，但不结合其他启动子（图 2A、B）。这三个 TF 属于 BLH 家族，表明 BLH蛋白家族在与CAld5H启动子的结合方面可能更具特异性。其他九个 TF 识别了木质素单体途径中其他基因的启动子（图 2A、B），表明它们调节木质素单体生物合成中的其他步骤。

图2 Y1H

为了研究两个 BLH6 同源物是否在体内调节CAld5H2，我们进行了基于效应子-报告基因的反式激活/抑制测定。报告基因构建体携带LUC荧光素酶基因，受白杨× P.腺体 CAld5H2启动子控制，并在本氏烟草叶片中瞬时共表达，效应子构建体包含来自白杨× P.的BLH6a或BLH6b 。BLH6a 抑制报告基因活性，但 BLH6b 没有（图 3A）。BLH2 还抑制CAld5H2启动子活性（图 3A）。我们进一步使用酵母系统来检测 BLH6a 的激活/抑制活性。BLH6a过表达的酵母不能在缺乏组氨酸的培养基上生长（图 3B），表明 BLH6a 不能激活HIS3表达。与单独的 VP16 相比，BLH16a:VP16 融合扰乱了 α-半乳糖苷酶基因的激活（图 3B），表明 BLH6a 是转录抑制因子，而不是激活因子。

图3 BLH6a 是P. alba × P. gearulosa中CAld5H2 的转录抑制因子

所有鉴定出的 12 个 TF 都可以结合CAld5H2的 556 bp 启动子区域。了解它们如何协同调节CAld5H2会很有趣。我们首先通过 Y2H 检测了 BLH6a 与其他两种CAld5H2特异性 TF BLH6b 和 BLH2 的相互作用，分析表明 BLH6a 可以与 BLH6b 和BLH2 形成二聚体（图 5A）。我们进一步对本氏烟草叶中的三个 BLH 成员进行了萤火虫 LCI 分析（图 5B）。当BLH6a-nLUC和cLUC-BLH2共同浸润时，检测到强烈的 LUC 信号，并且BLH2-nLUC和cLUC-BLH6a也有很强的发光性。类似地，当每对BLH6a-nLUC/cLUC-BLH6b、BLH6b-nLUC/-cLUC-BLH6a、BLH6b-nLUC/cLUC-BLH2和BLH2-nLUC/cLUC-BLH6b共渗入烟叶时，LUC 发光被观测到。然而，在阴性对照中没有观察到 LUC 发光。BLH6a、BLH6b 和 bHLH2 之间相互作用的 LCI 测定重复四次。都具有正发光，表明这三种蛋白质可以相互作用。

图5 BLH6a、BLH6b 和 BLH2 的蛋白质-蛋白质相互作用

文献链接： https://doi.org/10.3389/fpls.2021.695223