Verticillium dahliae Kleb.是一种引起双子叶植物枯萎病的植物病原真菌。

已有研究表明分泌体在V. dahliae的致病性中起重要作用。本研究对强毒力落叶V. dahliae的特异性分泌蛋白基因（VdSSP1）进行了研究。对V. dahliae菌株VDG1进行了克隆，并对其进行了分泌型蛋白信号肽活性测定。在以果胶和淀粉为碳源的培养基中，VDG1中的VDSSp1缺失突变体显著降低了真菌的毒力，真菌的生长受到抑制。VdSSP1缺失株或缺乏VdSSP1的低毒非落叶株VDG2互补后，其致病性和碳利用得到恢复。表明VdSSP1的毒力作用与植物细胞壁降解有关。综上所述，我们的数据表明VdSSP1是一种分泌蛋白，在V.dahliae病毒的高致病性中起作用。

中国农业科学院研究团队在Gene发表了一篇名为“Molecular characterization and functional analysis of a specific secretedprotein from highly virulent defoliating Verticillium dahliae”的文章揭示了棉花黄萎病菌特异性分泌蛋白的分子特征和功能。

1.1. VdSSP1基因的克隆及序列分析

VdSSP1是一个预测基因，属于特定的SCF73簇，存在于高毒力的V.dahliae。大丽花株VDG1的基因组在VDG2中缺失。以确保VdSSP1，设计引物以内部编码序列为靶点，从混合cDNA样本中扩增出转录片段。测序后，与预测的基因序列相比，对应于预测基因的转录序列的560bp基因VdSSP1被证实（图1A）。随后，一个808bp的碎片利用克隆的转录本进行3′RACE获得克隆5′RACE扩增701bp片段（图1C）。分析了预测基因VdSSP1的全长序列利用结果、转录本和基因组水平进行组装通过PCR进行验证（图1D）。此外，未能扩大VdSSP1来自VDG2CDNA或基因组DNA，表明VdSSP1是属于高毒力菌株VDG1的特定基因（图1D）。这些结果提示VdSSP1作为高毒力VDG1株的特异基因，编码一种潜在的分泌蛋白。

图1VdSSP1克隆过程的电泳分析

1.2. VdSSP1编码信号肽的功能验证

生物信息学分析表明，VdSSP1可能是一种分泌型蛋白 。因此，我们采用了酵母细胞在含有蔗糖或棉子糖培养基上进行蔗糖酶分泌预测VdSSP1信号肽（Jacobs）的功能分析。成功重组的载体pSUC2：：VdSSP1为反式进入酵母细胞检测信号肽活性。在CMD-W中培养基（含蔗糖，即使在没有转化酶的情况下酵母也能生长）和胰蛋白酶抑制剂（Trp）阴性对照，pSUC2，阳性对照，pSUC2：：Avr1b（Avr1b是一种分泌蛋白）在大豆疫霉中，pSUC2:：VdSSP1生长良好。在YPRAA培养基中（含棉子糖而不是蔗糖，生长只有当转化酶分泌），YTK12菌株和携带PSUC2的YTK12菌株没有生长，因为不分泌转化酶，但阳性对照pSUC2:：Avr1b和当信号肽激活细胞时，pSUC2：：VdSSP1正常生长转化酶。此外，pSUC2:：Avr1b和pSUC2:：VdSSP1导致TTC在福尔马赞试验中变为红色，表明信号肽Avr1b和VdSSP1的表达可介导转化酶的分泌（图2B）。这些结果表明VdSSP1的信号肽具有功能性，确认SignalP程序的预测是非常准确的。

图2.使用酵母转化酶分泌测定对VdSSP1的信号肽进行功能验证

1.3.用酶联免疫吸附法测定VdSSP1对V.dahliae菌毒力的贡献功能互补分析

在ΔVdSSP1-1突变体或VDG2菌株中对VdSSP1过表达植株进行互补分析，以进一步证实VdSSP1的毒力功能。选择了3个VdSSP1缺失突变株和VDG2株的互补转化子进行毒力检测。

与野生型相比，ΔVdSSP1突变体降低了棉花对感病植株的毒力。在突变体ΔVdSSP1-1中过量表达VdSSP1后，互补转化子的感染性恢复，因为大多数棉花植株在接种后6周出现完全萎蔫（图5A），DI值与野生型近似（p b 0.01）（图5B）。此外，在低毒力菌株VDG2中VdSSP1的过度表达也增强了棉花植株的感染性，因为Verticillium萎蔫症状与野生型诱导的症状相似（图5C）。接种VDG2菌株的棉花植株的DI值为21.36±1.01，在VDG2中异源表达的VdSSP1的三个转化子中，DI值增加到35.36±1.91到36.95±3.14，接近野生型值41.67±8.92（P0.05）（图5D）。这些结果有力地表明VdSSP1是高毒力落叶V致病所必需的。

图5 V.dahliae毒株的毒力检测

文献链接： https://doi.org/10.1016/j.gene.2013.06.089