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Journal of Neuroscience| 日本研究团队利用酵母信号肽跟踪筛选技术揭示了Goofy协调嗅觉信号的敏锐度

作者:南京瑞源生物技术有限公司 浏览: 发表时间:2021-07-09 14:46:01

从出生后第3天的小鼠OE中制备Poly(A)+RNA,逆转录,PCR扩增产生带有EcoRI和XhoI适配器的双链cDNA,用EcoRI和XhoI消化双链cDNA,用琼脂糖凝胶电泳(300–800bp)分离大小,并单向连接到pUSC2T7M13ORI载体,构建cDNA文库,筛选含信号肽序列的cDNAs将文库导入转化酶缺失酵母菌株YTK12中,选择含棉子糖的培养板,在含棉子糖的培养板上只生长含有cDNA衍生信号肽融合转化酶基因的转化子,在棉子糖培养板上生长的686个克隆中,对258个重组的cDNA插入片段进行了扩增和测序,在215个克隆中证实了一个假定的信号肽的存在,这些克隆编码49个单独的基因。

2013年日本研究团队在Journal of Neuroscience发表了一篇为“GoofyCoordinates the Acuity of Olfactory Signaling”的文章利用酵母信号肽跟踪筛选技术揭示了一种新型分子Goofy协调嗅觉信号的敏锐度。


在这项研究中,我们进行了小鼠OE cDNA文库的信号肽跟踪筛选并鉴定了一种新型跨膜蛋白,该蛋白在OSNs和犁鼻感觉神经元(VSNs)中特异性表达并主要位于高尔基体中。因此,我们将该基因产物命名为Goofy(嗅觉神经元中的高尔基蛋白)。Goofy基因的遗传消融导致ACIII异常定位,嗅觉纤毛缩短,对气味的敏感性降低,这表明Goofy在嗅觉系统的功能中起着至关重要的作用。

识别新的跨膜和分泌分子的信号肽跟踪筛选方案

 信号肽跟踪筛选获得的单个49cDNA克隆的汇总表

为了寻找与OSNs的发育和/或功能相关的膜结合或分泌蛋白,我们采用了酵母信号肽跟踪筛选技术,该方法使我们能够选择性地分离出具有N末端疏水性信号肽的cDNAs编码蛋白。从P3小鼠的OE中制备Poly(A)+RNA,并在信号肽跟踪筛质粒(pSUC2T7M13ORI)中构建cDNA文库,该质粒含有无信号序列的截断转化酶基因。当cDNA文库被导入转化酶缺陷酵母菌株YTK12由于截短的转化酶与cDNA衍生的信号肽的框内融合,只有686个能够分泌转化酶的转化子能够在无葡萄糖、含棉子糖的平板上生长。在已测序的258个克隆中,215个克隆(83.3%)含有带有一段疏水氨基酸的典型信号肽,其中包括12个新基因(图1A,B)。随后,我们在小鼠头部切片上对这些基因进行了原位杂交分析,并确定了在OE中具有特异和稳健表达的克隆#123(指定为Goofy)。

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从出生后第3天的小鼠OE中制备Poly(A)+RNA,逆转录,PCR扩增产生带有EcoRI和XhoI适配器的双链cDNA,用EcoRI和XhoI消化双链cDNA,用琼脂糖凝胶电泳(300–800bp)分离大小,并单向连接到pUSC2T7M13ORI载体,构建cDNA文库,筛选含信号肽序列的cDNAs将文库导入转化酶缺失酵母菌株YTK12中,
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