中国科学院植物研究所酵母单杂交文库筛选客户案列展示

客户提供

诱饵基因序列信息 
酵母文库原始质粒:(60ug共转), 
cDNA文库报告:冗杂,库容量、空载率、
插入片段大小、文库浓度


公司承诺

文库库容量>1*10^7CFU
平均插入片段>1.2Kbp
空载率<5%
文库质粒>100ug

技术路线

1


文库质量评估

理论+涂板评价

交付材料:反馈质量评估结果


2


载体构建

基因合成诱饵基因   

构建Phis2载体

交付材料:含诱饵基因的质粒


3


启动子背景筛查

Binding seq基因启动子的背景筛查

交付材料:阳性克隆测序结果    

              word项目报告


4


文库筛选

诱饵质粒转化和文库质粒转化

酵母筛选和3AT条件优化    

筛选结果测序

交付材料:阳性克隆测序结果     

              word项目报告


5


回转验证

筛选结果回转验证    

数据整理和分析

交付材料:阳性克隆酵母质粒    

              word项目报告





实验结果

自激活检测

不同浓度3AT平板启动子自激活检测结果

实验结论

阳性对照由于HIS3报告基因的激活,在添加3AT抑制剂的平板上能正常生长不受影响,转化子数量与不添加3AT相同,但是实际观察到的生长值是比不添加3AT的平板约有10%的降低,并且随着3AT浓度增加,生长率会降低,但与阴性对照仍然有显著差别。

阴性对照由于HIS3报告基因未被激活,在添加3AT的平板上生长明显减少,并且3AT浓度越高,转化子数量越少,在添加50mM3AT的SD-TLH平板上,只有少量菌生长。
由自激活检测结果看出,在添加10 mM 3AT 的平板上转化子生长明显受到抑制,没有菌落生长,显示未激活HIS3报告基因。


阳性克隆回转验证His和Ade报告基因的检测


筛库阳性克隆His3报告基因检测结果

实验结论

提取阳性酵母DNA后与GenBank数据库中的序列进行BLAST比对分析,共筛选到43个阳性克隆

在HIS3报告基因的检测结果中,可以看到,阳性对照、阴性对照在SD-TL、SD-TLH + 10 mM 3AT均能正常生长。注:阴性对照3AT的抑制浓度为50mM,所以可以在10mM3AT浓度的平板上生长。

在43个初始克隆阳性克隆中,在SD-TL、SD-TLH + 10 mM 3AT均能正常生长,结果表明这43个克隆与启动子pHIS2-ZT存在互作。

 

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