水稻是世界上一半以上人口最重要的主食作物。杂交水稻的产量比常规水稻高出20%-30%，是农业领域的一项重要成就，对世界粮食供应做出了重大贡献。水稻是一种自花授粉作物，杂交制种以雄性不育系为基础。茉莉酸盐（JAs）在调控花发育，尤其是花药发育中起着重要作用。JA生物合成途径上的基因功能丧失导致拟南芥出现各种雄性不育突变体。特别是花药裂开缺陷1和苯妥英酯还原酶3突变体在花药开裂、花粉成熟、花丝伸长和开花等方面表现出异常。通过应用茉莉酸甲酯或亚麻酸可以恢复这些突变体的生育能力。水稻OsOPR7基因与AtOPR3基因具有很高的核苷酸序列相似性，参与水稻的JA生物合成，并且OsOPR7在拟南芥opr3突变体中的表达通过恢复JA产量来恢复突变体的生育能力。

近日，浙江大学与金日成大学研究人员在期刊Plant Biotechnol J（IF:8.154）发表了一篇名为”Creation of male-sterile lines that can be restored to fertility by exogenous methyl jasmonate for the establishment of a two-line system for the hybrid production of rice (Oryza sativa L.)“的文章,在研究中，研究人员应用CRISPR/Cas9在水稻OsOPR7处产生插入/缺失突变。CRISPR/Cas9诱导的osopr7突变体为雄性不育，外源MeJA可恢复其育性。在现有的PGMS/TGMS系统的基础上，osopr7雄性不育系的成功育成，为建立水稻杂交生产的两系体系铺平了道路。

分析多种植物物种中OPR直系同源基因 的序列相似性和结构

三个获得OPR在拟南芥中，只有OPR3参与生物合成JA。番茄中有3个OPR直系同源基因，玉米中有8个，水稻中有10个。基于这些OPR直系同源基因的核苷酸序列，我们分析并比较了这些基因的结构，并形成了系统发育树。24个OPR直系同源物在拟南芥，水稻，玉米和番茄。所述获得OPR可以被分类成三个分支，每一个具有不平坦数目的成员。AtOPR3和OsOPR7位于进化枝III中，具有高度相似的核苷酸相似性，并具有密切的系统发育关系。AtOPR3包含四个外显子和三个内含子，而OsOPR7包含五个外显子和四个内含子。OsOPR7具有较长的内含子序列，因此比AtOPR3具有更长的全基因组序列。但是，AtOPR3和OsOPR7具有几乎相同的编码序列。

跨物种的直系同源蛋白受体

鉴定可通过外源MeJA恢复其育性的雄性不育T 0突变体

我们比较了野生型（ZH11）与两个T0 osopr7突变体，即OS2＃03（A3A4）和OS2＃09（a8a9），其中OS2代表外显子2的靶向突变，后面的数字代表个体。Os2＃09和Os2＃03花药不裂且平行。我们将T0-T2的所有世代幼苗分为两部分，分别用于观察花药不育和MeJA恢复。突变体的小穗外观与ZH11的外观没有显着差异。但是，与ZH11相比，当Os2＃03和Os2＃09花药不开裂时，在花朵的完全开放阶段观察到了小穗外观的明显差异。当从花朵上取下内稃的碎片时时，花朵内部的差异更加明显。红色圆圈内 ，ZH11的雌蕊上观察到大量的花粉粒，在经过MeJA处理的Os2＃03和Os2＃09的雌蕊上可见少量的花粉粒。相比之下，未经MeJA处理的Os2＃03和Os2＃9的雌蕊几乎未观察到花粉粒。

ZH11（对照），未经MeJA处理的T0 osopr7植物（Os2＃3）和经过MeJA处理的T ⁰ osopr7植物（Os2＃3和Os2＃9）之间的花形比较

osopr7t1和t2植株的获得及其育性恢复

考虑到所有的T0突变体都是裂开且平行的，我们以Os2#09为例观察了T1和T2后代。未经MeJA处理的Os2#09半株和经MeJA处理的Os2#09半株在成熟期看起来相似。然而，它们的圆锥花序是不同的；也就是说，没有MeJA处理的Os2#09植株具有纤细的圆锥花序，没有饱满的种子，而经过MeJA处理的Os2#09植株在其圆锥花序上产生了大量的种子，尽管明显少于野生型圆锥花序上的种子。通过MeJA处理，我们能够从Os2#09（a8a9）植株中收获种子，并为t1植株培育种子，因为通过MeJA处理恢复了T0Os2#09植株的雄性育性。未经MeJA处理的T1Os2#9植株与ZH11和Os2#09-3有MeJA处理的植株相比，花药内的花粉粒较少。我们从每一朵花上取下一块内稃，这样就能清楚地看到花的内部部分。ZH11的花药是空的，因此很薄，并且ZH11雌蕊出现，可见花粉粒从花药脱落。经MeJA处理的Os2#09-3植株花药开裂，但仍较厚ZH11。值得注意的是，未经MeJA处理的Os2#09-3植株的花药不裂，没有花粉落在雌蕊上。OsOPR7基因在ZH11花药中的表达是T10s2#09科8种植物的25.6倍。

野生型（ZH11）与未经MeJA处理的osopr7植株和经MeJA处理的osopr7植株在成熟植株外观、圆锥花序、花粉粒和花形态方面的比较

雄性不育在水稻杂交种子生产中得到了广泛的应用，但由于保持雄性不育系的人工成本较高，使其应用受到限制。以往利用T-DNA插入突变技术的研究表明，干扰茉莉酸生物合成途径中的酮苯二甲酸还原酶3（OPR3）的表达，可导致拟南芥雄性不育，并可通过外源茉莉酸恢复其育性。在这里，我们通过聚集的规则间隔的短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR相关系统9编辑水稻OsOPR7的第二和第四外显子，创造了雄性不育突变。这些外显子的诱变使t0代不育率分别为31.8%和23.9%。我们在T0、t12和T2三个水稻群体中筛选出能通过外源茉莉酸甲酯恢复育性的雄性不育系，并对转基因植株的花药和农艺性状进行了分析。结果表明，通过对拟南芥OPR3同源基因OsOPR7的沉默，成功地育成了水稻雄性不育系，为建立两系杂交水稻生产体系奠定了基础。该系统由一个可以通过喷洒茉莉酸甲酯来维持的雄性不育系和一个产生花粉的恢复系组成。

参考文献：

【1】Bai, S., Yu, H., Wang, B. and Li, J. (2018) Retrospective and perspective of rice breeding in China. J. Genet. Genom. 45, 603–612.

【2】Basnet, R., Hussain, N. and Shu, Q. (2019) OsDGD2b is the sole digalactosyldiacyl glycerol synthase gene highly expressed in anther, and it’s mutation confers male sterility in rice. Rice, 12, 66.

【3】Breithaupt, C., Kurzbauer, R., Lilie, H., Schaller, A., Strassner, J., Huber, R.,Macheroux, P. and Clausen, T. (2006) Crystal structure of 12 oxophytodienoate reductase 3 from tomato: Self-inhibition by dimerization.Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103, 14337–14342.

文献链接： https://doi.org/10.1111/pbi.13471

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