西弗吉尼亚大学研究揭示线粒体代谢对于酿酒酵母暴露于草甘膦基除草剂的反应和抗性至关重要

草甘膦除草剂在世界各地的广泛使用,导致了草甘膦对植物、细菌和高等真核生物影响的广泛研究。对除草剂抗性的研究已经进行了几十年,主要集中在草甘膦上。然而,草甘膦除草剂(GBHs)及其添加剂的潜在负面影响直到最近几年才被认识到。芳香氨基酸途径是草甘膦的典型靶点。除草添加剂虽然声称是中性的,但与草甘膦结合时具有交互作用。评估草甘膦除草剂抗性的遗传变异是解决这些添加剂毒性途径的一种方法。对GBHs反应的变化不仅在于生物体的遗传组成,而且还在于添加到具有相同活性成分的除草剂中的佐剂和表面活性剂的成分和浓度的变化。最近的研究表明,草甘膦类除草剂的毒性不仅与主要成分有关,更与各种剂型中的添加剂有关。

 

美国西弗吉尼亚大学研究人员在期刊Environ. Pollut上发表了一篇名为Mitochondrial metabolism is central for response and resistance of Saccharomyces cerevisiae to exposure to a glyphosate-based herbicide的文章,研究人员通过研究制剂Credit41在两种遗传多样的酵母菌株RM11和S288c中的作用,揭示了草甘膦除草剂中的添加剂对这些商业制剂对生物系统的负面影响。


研究利用Credit41(Cr41)暴露后菌株RM11和S288c之间的反应差异来进行数量性状基因座(QTL)分析,发现抗性与含有编码线粒体脂肪酸生物合成的线粒体蛋白基因的位点有关。进化出对Cr41抗性的细胞的转录组学数据和全基因组测序数据表明,线粒体内的铁稳态有助于暴露于这种环境压力源的细胞的抗性表型,可能涉及细胞色素和铁硫(Fe-S)簇。在Credit41暴露下,耐药细胞(RM11)的铁浓度显著增加,这可能是其耐药表型的原因之一。铁转运水平的增加对商业配方Cr41和非纯草甘膦(PG)是特定的,表明观察到的影响不是主成分的结果,而是添加剂及其协同作用的结果。

 

研究方法

遗传连锁图谱分析

构建突变体并通过酵母斑点实验进行基因表达分析

全基因组测序及转录组分析

ICP元素分析

 

研究结论

草甘膦类除草剂是世界上使用最广泛的除草剂,有大量的商业配方,含有不同的添加剂和佐剂。我们研究了一个敏感的实验室菌株和一个抗性菌株之间的数量性状基因座(QTL)分析将线粒体功能与Credit41抗性联系起来。通过QTL分析确定的两个编码线粒体蛋白质的基因是HFA1(一个编码线粒体乙酰辅酶a羧化酶的基因)和AAC3(编码线粒体内膜ATP/ADP转运体)的基因。对先前研究的全基因组测序数据的进一步分析表明,尽管每个菌株通过不同的途径获得抗草甘膦的能力,但大多数菌株都有线粒体基因的重复。线粒体的一个最深入研究的功能是Fe-S簇的组装。在目前的研究中,铁转运体在转录组中的表达在对Credit41耐药的细胞中增加。细胞内的铁含量也在暴露于Credit41的细胞中增加,但不包括纯草甘膦。因此,草甘膦除草剂中的添加剂对这些商业制剂对生物系统的负面影响有重要贡献。

分析实验室内进化中受影响的基因及其与线粒体的关系

 

参考文献

1Amrhein, N., Deus, B., Gehrke, P., Steinrücken, H.C., 1980. The site of the inhibition of the shikimate pathway by glyphosate, 66, 830e834.

2Ausubel, F.M., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., et al., 1995. Short Protocols in Molecular Biology, vol. 1995.

3Becher, M.W., Wills, M.L., Noll, W.W., Hurko, O., Price, D.L., 1999. Kearns-Sayre syndrome with features of Pearson’s marrow-pancreas syndrome and a novel 2905-base pair mitochondrial DNA deletion. Hum. Pathol. 30, 577e581.

 

酵母高通量筛选

酵母菌为真核生物,与植物、动物表达系统更为接近,也具有糖基化、二硫键形成以及蛋白质折叠翻译后加工等过程,从而使得筛选出的植物基因所编码的蛋白功能正常发挥,多重逆境抗性基因假阳性的概率大大降低。利用酵母菌,在逆境系统下,检测酵母菌表达可溶性蛋白是否可以帮助酵母菌度过逆境胁迫。通过抗性梯度实验对基因组范围内的抗性相关基因进行筛查,并对筛查的结果进行了生物信息学分析,将这些抗逆基因进行归纳、分类。

 

实验流程

酵母高通量筛选抗逆基因

抗逆基因功能性验证


技术特点

高通量筛选:酵母高通量抗逆基因筛选服务能够快速筛选岀非模式抗逆物种资源中的多重逆境抗性相关的大量基因,将具有非常重要的意义。

可溶性真核表达:利用蛋白组学寻找候选蛋白,进行蛋白水平上的表型验证。

敏感性酵母菌株:YCF1/BY4741/ InVSCI,是单细胞真核微生物,具有生长迅速,易于遗传操作,可分泌表达外源蛋白等特点,能对外源蛋白进行翻译后的加工和修饰,是表达外源蛋白的合适宿主。

pYES2 载体:是为检测重组蛋白在酵母中诱导表达情况而设计的,该载体含有诱导性启动子 GAL,在半乳糖存在情况下,大量诱导外源蛋白表达,而在葡萄糖存在的情况下,抑制外源蛋白表达,且含有ura3 基因,利于对ura3 缺失体宿主菌阳性克隆的筛选。


应用领域

耐药性:药用生物耐药机制研究等

重金属:生物重金属修复机制研究等

抗逆性:生物抗逆性功能蛋白研究等

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西弗吉尼亚大学研究揭示线粒体代谢对于酿酒酵母暴露于草甘膦基除草剂的反应和抗性至关重要
草甘膦除草剂在世界各地的广泛使用,导致了草甘膦对植物、细菌和高等真核生物影响的广泛研究。对除草剂抗性的研究已经进行了几十年,主要集中在草甘膦上。然而,草甘膦除草剂(GBHs)及其添加剂的潜在负面影响直到最近几年才被认识到。
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