国际研究人员利用酵母高通量筛选技术对盐胁迫和热胁迫逆境条件下组蛋白残基在转录调控中的作用提供了新的见解

西班牙蓬皮亚法布拉大学研究人员在期刊Nucleic Acids Res(IF:11.501)上发表了名为“A geneticanalysis reveals novel histone residues required for transcriptional reprogramming upon stress”的文章,文章中介绍了研究人员利用酵母高通量筛选技术揭示了激酶Cla4和Ste20,哺乳动物PAK2家族的酵母同源物,以及ste11mapk分别作为H4-S47和H4-T30的调节器的新作用。这项研究为组蛋白残基在应激条件下转录调控中的作用提供了新的见解。


研究结果

为了应对环境的波动,酵母细胞诱导应激反应基因的快速大量转录和生长相关基因的下调。由于组蛋白在转录相关过程中起着关键作用,研究人员试图确定组蛋白残基对应激时转录重编程至关重要。为此,通过高通量筛选,测量了569个组蛋白点突变体在单细胞水平上对应激反应的转录启动。在三种不同的转录因子调控下,用转录因子调控的四种转录因子调控的转录反应;HSP82,热应激诱导,Hsf1控制;STL1,渗透胁迫诱导,Hot1和Sko1调节。将含有这些报告基因的查询菌株与上述组蛋白文库进行高通量交配,使我们能够生成既包含组蛋白点突变又包含报告基因的新库。接下来,我们用流式细胞术分析热休克(39℃)和渗透胁迫(0.4 M NaCl)后pALD3 qV的表达,热应激时pHSP82qV和渗透胁迫下pSTL1 qV的表达,比较野生型和突变株的折叠诱导。

图:应激时转录调控所需组蛋白残基的高通量筛选


为了评估H4-S47D和H4-T30突变体及其转录变化与渗透胁迫和热胁迫下细胞生长的相关性,研究人员监测了高渗透压(1.2mnacl)和热胁迫(39℃)存在下的细胞生长。与野生型细胞相比,不可磷酸化的H4-S47A突变体对渗透胁迫的反应没有表现出主要的生长差异;相反,模拟该组蛋白位点的磷酸化(H4-S47D突变细胞)在平板和液体培养中的高渗透压条件下明显损害生长。值得注意的是,这种拟磷酸突变体已经在基础条件下表现出细胞生长的轻微下降,残基H4-S47和H4-T30的磷酸化有助于调节转录应激反应。

突变体在渗透胁迫和热胁迫下的生长反应 


酵母高通量筛选


   何为酵母高通量筛选验证?


酵母菌为真核生物,与植物、动物表达系统更为接近,也具有糖基化、二硫键形成以及蛋白质折叠翻译后加工等过程,从而使得筛选出的植物基因所编码的蛋白功能正常发挥,多重逆境抗性基因假阳性的概率大大降低。利用酵母菌,在逆境系统下,检测酵母菌表达可溶性蛋白是否可以帮助酵母菌度过逆境胁迫。通过抗性梯度实验对基因组范围内的抗性相关基因进行筛查,并对筛查的结果进行了生物信息学分析,将这些抗逆基因进行归纳、分类。


技术特点

高通量筛选

酵母高通量抗逆基因筛选服务能够快速筛选岀非模式抗逆物种资源中的多重逆境抗性相关的大量基因,将具有非常重要的意义。

可溶性真核表达 

利用蛋白组学寻找候选蛋白,进行蛋白水平上的表型验证。

敏感性酵母菌株

YCF1/BY4741/InVSCI,是单细胞真核微生物,具有生长迅速,易于遗传操作,可分泌表达外源蛋白等特点,能对外源蛋白进行翻译后的加工和修饰,是表达外源蛋白的合适宿主。

pYES2载体

是为检测重组蛋白在酵母中诱导表达情况而设计的,该载体含有诱导性启动子 GAL,在半乳糖存在情况下,大量诱导外源蛋白表达,而在葡萄糖存在的情况下,抑制外源蛋白表达,且含有ura3 基因,利于对ura3 缺失体宿主菌阳性克隆的筛选。

应用领域

 耐药性:药用生物耐药机制研究等

                                                                                     重金属:生物重金属修复机制研究等

    抗逆性:生物抗逆性功能蛋白研究等

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国际研究人员利用酵母高通量筛选技术对盐胁迫和热胁迫逆境条件下组蛋白残基在转录调控中的作用提供了新的见解
为了应对环境的波动,酵母细胞诱导应激反应基因的快速大量转录和生长相关基因的下调。由于组蛋白在转录相关过程中起着关键作用,研究人员试图确定组蛋白残基对应激时转录重编程至关重要。为此,通过高通量筛选,测量了569个组蛋白点突变体在单细胞水平上对应激反应的转录启动。
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