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J. Exp. Bot.| 中国农业大学通过酵母单杂、亚细胞定位和VIGS等技术揭示GhNAC83通过调节ABA信号转导和生物合成抑制唐菖蒲球茎休眠解除

J. Exp. Bot.| 中国农业大学通过酵母单杂、亚细胞定位和VIGS等技术揭示GhNAC83通过调节ABA信号转导和生物合成抑制唐菖蒲球茎休眠解除

中国农业大学的研究人员于J. Exp. Bot.上发表了一篇题为“GhNAC83 inhibits corm dormancy release by regulating ABA signaling and CK biosynthesis in Gladiolus hybridus.”的研究文献,该文献揭示了GhNAC83通过调节ABA信号转导和对照生物合成抑制唐菖蒲球茎休眠解除。

文章来源

背景

球茎休眠是唐菖蒲等许多种球花育种的重要性状。唐菖蒲球茎是经过改良的地下茎,具有储藏器官的功能,可以在不利的环境条件下生存。本文研究了唐菖蒲球茎休眠解除的机理。通过对 CDR的转录分析,我们确定了一个重要的脱落酸(ABA)信号调节因子GhPP2C1。通过酵母单杂交筛选,发现 GhNAC83直接调控了GhPP2C1的表达。


结果

GhPP2C1促进唐菖蒲球茎休眠的解除

为了研究唐菖蒲发芽的分子机制,研究了唐菖蒲不同时期的发芽情况并进行转录组测序。在转基因过程中,植物激素生物合成(玉米素和脱落酸)和激素转导高度丰富,支持了这些激素在球茎休眠解除中的作用。

唐菖蒲球茎休眠释放的转录组分析

1.唐菖蒲球茎休眠释放的转录组分析

ABA和细胞分裂素参与球茎休眠释放

2. ABA和细胞分裂素参与球茎休眠释放

PP2C是核心ABA信号转导模块的一部分,参与种子休眠。为了研究PP2CCDR中的功能,在转录组中鉴定了其154个成员。在开花植物的不同器官中评估了GhPP2C1的表达,观察到在几乎所有器官中均表达。进一步结果表明GhPP2C1可以调节CDR。使用VIGS方法研究了GhPP2C1CDR中的作用, 结果表明在休眠球茎中GhPP2C1的下调导致CDR延迟,表明GhPP2C1充当了CDR的正调节剂。

GhPP2C1基因在唐菖蒲中的表达模式

3.GhPP2C1基因在唐菖蒲中的表达模式

GhPP2C1参与球茎休眠的解除

4.GhPP2C1参与球茎休眠的解除

GhNAC83GhPP2C1的负调节剂

为了进一步探索CDR期间GhPP2C1的调控,我们通过Hi-TAIL PCR 分离了翻译起始位点上游的GhPP2C1调控区的1.5 kb序列。基于顺式元素的分布,截短了启动子,并在烟草叶片中进行了瞬时表达分析。结果表明,当删除区域I(–1285–833),启动子活性不受影响;但是,II区的缺失(–833–615)导致启动子活性急剧下降。

GhNAC83结合GhPP2C1启动子并抑制其转录

5. GhNAC83结合GhPP2C1启动子并抑制其转录

为了鉴定结合GhPP2C1启动子该区域的TF,使用来自拟南芥属的TF文库进行了酵母单杂交筛选。考虑到CDR中的表达水平和从酵母单杂交筛选中鉴定出的克隆数,选择了GhNAC83GlaUn057212)用于进一步研究。GhNAC83结合天然的GhPP2C1启动子,但不能结合突变型启动子。此外,为了进一步测试GhNAC83GhPP2C1转录的影响,进行了瞬时反式激活分析。GhNAC83显著抑制了GhPP2C1 的表达。进一步分析以确定植物体内GhNAC83 GhPP2C1启动子的调节。结果表明,GhNAC83降低了GhPP2C1启动子的活性。GhNAC83直接结合GhPP2C1启动子,并负面调节其在植物中的表达。


GhNAC83 在球茎休眠释放期间被下调

为了更好地了解GhNAC83的功能,分析了其序列和表达模式。转录组数据显示,GhNAC83CDR中被下调的10GhNAC之一。GlaUn078410显示出与GhNAC83相似的趋势,并且与拟南芥中的ATAF1和水稻中的OsNAC6具有高度的序列相似性。已证明ATAF1OsNAC6参与ABA信号传导。结果证明在植物中GhNAC83负调节GhPP2C1 CDR

为了研究GhNAC83在转录调控中的潜在作用,研究了GhNAC83在细胞中的亚细胞定位。结果表明,GhNAC83-GFP融合蛋白定位于细胞核。另外,在酵母中进行反式激活活性测定以研究GhNAC83的反式激活能力。数据表明,GhNAC83在其C末端区域的氨基酸161219之间包含一个反式激活结构域。结果表明GhNAC83是一种双功能TF

GhNAC83的表达模式和蛋白质特性

6. GhNAC83的表达模式和蛋白质特性

沉默 GhNAC83 加速球茎休眠释放

为了研究GhNAC83在唐菖蒲中的潜在作用,进行了VIGS研究。结果当GhNAC83沉默时,加速了种子发芽。为了证实GhNAC83基因沉默对GhPP2C1基因转录的影响,测定了GhPP2C1基因在GhNAC83基因沉默株系中的表达水平。 结果表明,GhPP2C1 GhNAC83沉默系中表达量较高。结合测定结果,数据表明GhNAC83负调控 GhPP2C1 表达并抑制CDR

沉默GhNAC83可加速球茎休眠释放

7. 沉默GhNAC83可加速球茎休眠释放

GhNAC83通过直接靶向GhNAC83启动子介导CK生物合成

为了进一步研究GhPP2C1GhNAC83如何影响CDR,测定了GhNAC83沉默植株中内源性植物激素水平。与TRV2植株相比,GhNAC83沉默植株只有一半的ABA含量,并且玉米素水平显著增加。该结果表明,GhNAC83可能在CDR期间参与ABACK之间的拮抗作用。GhNAC83可能在不依赖于GhPP2C1的情况下介导玉米素的生物合成。对ABA来说,沉默GhNAC83会降低ABI5下游基因的表达,而沉默GhPP2C1则相反。总体而言,这些结果表明,GhNAC83可以通过GhPP2C1影响ABA信号传导反应,并且GhNAC83ABA和玉米素水平有拮抗作用。

GhNAC83以GhPP2C1独立介导CK的生物合成

8. GhNAC83GhPP2C1独立介导CK的生物合成

为了研究CK生物合成基因GhCYP735AGhIPTCDR中的作用,采用了VIGS 结果表明,抑制 GhCYP735AGhIPT基因的导致发芽延迟。沉默植株花蕾和根明显短于TRV2对照。 此外,CDR标记 GhdUTPase的表达显著低于TRV2。结果表明沉默CK生物合成基因降低了植株中CK含量并进一步抑制了CDR

细胞分裂素生物合成基因的沉默延迟了球茎休眠的释放

9. 细胞分裂素生物合成基因的沉默延迟了球茎休眠的释放

为了确定GhNAC83是否可以直接调节CK生物合成基因的表达,我们通过Hi-TAIL PCR 克隆了一个1594 bpGhIPT上游序列。使用酵母单杂交法发现GhNAC83结合GhIPT启动子的T2片段,而T2片段中NAC结合位点的突变导致其没有结合能力。进行了LUC以分析GhNAC83 在植物中对GhIPT表达的调节。与35SGhNAC83GhIPTLUC共转化的本生烟草叶细胞的活性明显低于用空载体和GhIPTLUC转化的细胞。数据表明,GhNAC83负调控植物体内的GhIPT。总之,结果表明,GhNAC83直接结合GhIPT启动子,在CK生物合成负调节GhPP2C1

GhNAC83对唐菖蒲球茎休眠解除的调控

10. GhNAC83对唐菖蒲球茎休眠解除的调控

结论

在这项研究中,我们在唐菖蒲中确定了一个新的NAC成员GhNAC83,并分析其在CDR的负调节作用。这些发现表明,GhNAC83通过调节ABACK通路,从而控制球茎休眠。我们的发现揭示了GhNAC83在调节植物休眠中调控ABACK途径中的作用。

该研究受到国家自然科学基金的支持。


参考文献

1Ashikari M, Sakakibara H, Lin S, et al. 2005. Cytokinin oxidase regulates rice grain production. Science 309, 741-745.

2Bolger AM, Lohse M, Usadel B. 2014. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics, btu170. doi: 10.1093/bioinformatics/btu170.

3Bozhkov PV, Lebedenko LA, Shiryaeva GA. 1992. A pronounced synergistic effect of abscisic acid and 6-benzyladenine on Norway spruce (Picea abies L. Karst) somatic embryo maturation. Plant Cell Reports 11, 386-389.

文献链接

https://doi.org/10.1093/jxb/ery428

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球茎休眠是唐菖蒲等许多种球花育种的重要性状。唐菖蒲球茎是经过改良的地下茎,具有储藏器官的功能,可以在不利的环境条件下生存。本文研究了唐菖蒲球茎休眠解除的机理。通过对 CDR的转录分析,我们确定了一个重要的脱落酸(ABA)信号调节因子GhPP2C1。通过酵母单杂交筛选,发现 GhNAC83直接调控了GhPP2C1的表达。
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