New Phytologist|四川农业大学通过CRISPR/Cas9和Western Blot 等技术揭示Osa‐miR398b通过SOD提高稻瘟病抗性和过氧化氢含量

New Phytologist|四川农业大学通过CRISPR/Cas9Western Blot 等技术揭示Osa‐miR398b 通过SOD提高稻瘟病抗性和H2O2含量

四川农业大学水稻研究所的研究人员于New Phytologist上发表了一篇题为“Osa-miR398b boosts H2O2 production and rice blast disease-resistance via multiple superoxide dismutases”的研究文献,该文献通过CRISPR/Cas9Western Blot 等技术揭示Osa‐miR398b 通过多种超氧化歧化酶(SOD)提高H2O2含量和水稻对稻瘟病菌的抗性。

文章来源

背景

植物中活性氧(ROS)的产生响应于生物和非生物胁迫,植物中ROS的合成和平衡状态受一系列酶的调节,例如超氧化酶歧化酶(SOD),过氧化氢酶(CAT)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)miRNA是一类非编码RNA,通过调控靶向基因的表达在植物发育和防御反应中发挥重要作用。以前的研究发现miR398b在水稻抗病中发挥功能。但其潜在机制尚不清楚。在这项研究中,表征了miR398b目标基因的突变体,并证明了多种SOD基因有助于miR398b调节水稻对稻瘟病菌的抗性。

结果

miR398b抑制SODX表达

为了确定是否存在miR398b抑制SODX,构建了表达YFP载体,并在其5'-末端或突变靶位上与推测的SODX目标位点融合。与miR398b共表达时,35S:SODX mts-YFP明显低于本氏烟草中的表达,但与MIM398共表达时可恢复。结果表明miR398b抑制SODX表达,miR398b抑制SOD基因家族的四个靶基因。

MiR398b抑制过氧化物酶歧化酶SODX的表达

1. MiR398b抑制过氧化物酶歧化酶SODX的表达

miR398b靶基因突变体对稻瘟病菌敏感性不同

使用CRISPR/Cas9技术修饰了四个靶基因,并确定了CSD1CSD2SODXCCSD等相关突变体,研究了这些突变体对稻瘟病真菌的敏感性。观察结果表明,miR398b的不同靶基因在抗性中发挥不同的作用。CSD1CSD2SODX可能会对抗病性产生负调控作用,但CCSD可能增强水稻稻瘟病抗性。

mir398b 靶基因突变位点的研究

2.mir398b 靶基因突变位点的研究

miR398b靶基因的突变改变了对稻瘟病菌的敏感性

3.miR398b靶基因的突变改变了对稻瘟病菌的敏感性

miR398b靶基因的过表达增强水稻对稻瘟病菌的敏感性

构建了表达MIM398的转基因品系,结果发现MIM398品系显著提高了miR398b四个靶基因的mRNA量,且MIM398系更易受病菌侵害。结果表明,miR398b靶基因的上调促进了稻瘟病菌的生长。这可能是通过抑制水稻的抗性来实现的,可以通过沉默miR398b来增强抗稻瘟病的能力。

过表达miR398b蛋白增强了对稻瘟病菌的敏感性

4.过表达miR398b蛋白增强了对稻瘟病菌的敏感性

为了进一步确定靶基因在水稻抗病中的作用,构建了过表达miR398b不敏感的CCSDm-GFP(OXCCSD)CSD2m-GFP(OXCSD2)的转基因品系。观察结果表明,CSD2m-GFP具有功能性,并且对稻瘟病抗性具有负调节作用。

过表达后,csd2和ccsd 的 mRNA 和蛋白水平升高

5.过表达后,csd2ccsd mRNA 和蛋白水平升高

过表达的CSD2增强了对稻瘟病菌的敏感性

6. 过表达的CSD2增强了对稻瘟病菌的敏感性

miR398b及其靶基因感染稻瘟病菌后调节ROS浓度

H2O2的积累是水稻对稻瘟病菌的常见防御反应,为了研究H2O2积累是否有助于抗性,研究了所有品系中的H2O2浓度。结果表明,miR398b对积累H2O2具有正向调节作用,过表达靶基因对稻瘟病菌诱导的H2O2积累无积极作用。进一步研究发现,在感染稻瘟病菌后,miR398b的过表达或CSD1CSD2SODX的突变将导致更高的ROS浓度,从而增强抗性。

稻瘟病菌感染后miR398b的过表达或靶基因的突变会影响活性氧(ROS)浓度

7.稻瘟病菌感染后miR398b的过表达或靶基因的突变会影响活性氧(ROS)浓度

Ox398b和突变植株叶片切片显示了H2O2和O2的积累

8.Ox398b和突变植株叶片切片显示了H2O2O2的积累

miR398b及其靶基因调节CSD表达和活性

植物中将O2-还原成H2O2主要由SOD发挥作用,水稻中有15SOD基因,包括4CSD4SOD和另外7个相关的伴侣蛋白。研究了这些基因的表达水平在OX398b和突变体中是否发生了改变。结果发现OX398b品系均显示CSD1CSD2CSD3的水平显著降低,表明miR398b的过表达导致CSD表达降低;几乎所有突变株都显示出四个CSD mRNA含量较少或不变,表明稻瘟病菌抑制了CSD表达。

miR398b的过表达或靶基因的突变会影响CSD浓度和酶活性

9. miR398b的过表达或靶基因的突变会影响CSD浓度和酶活性

miR398b及其靶基因调节SOD浓度和酶活性

为了研究其他SOD家族基因是否有助于OX398bcsd1csd2sodx H2O2浓度的升高,测定了了其他SOD家族成员的mRNA含量和总SOD酶活性。数据表明,在感染稻瘟病菌后,miR398b使靶基因CSD1CSD2SODX沉默,从而触发其他SOD家族成员的上调,导致更高的总SOD酶活性,提高了的H2O2产生和稻瘟病菌抗性。

miR398b的过表达或靶基因的突变会影响总超氧化物歧化酶(SOD)浓度和酶活性

10. miR398b的过表达或靶基因的突变会影响总超氧化物歧化酶(SOD)浓度和酶活性

结论

我们的结果证明了不同的SODmiR398b调节的对稻瘟病的抗性中的作用,并揭示了一个综合的调控网络,其中miR398b增强了总SOD活性以上调H2O2的浓度,从而提高了抗病性。

该研究受到国家自然科学基金的支持。

参考文献

1Boller T, He SY. 2009. Innate immunity in plants: an arms race between pattern recognition receptors in plants and effectors in microbial pathogens. Science 324: 742–744.

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3Candar-Cakir B, Arican E, Zhang B. 2016. Small RNA and degradome deep sequencing reveals drought and tissue-specific microRNAs and their important roles in drought-sensitive and drought-tolerant tomato genotypes. Plant Biotechnology Journal 14: 1727–1746.

文献链接

https://nph.onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/nph.15678

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植物中活性氧(ROS)的产生响应于生物和非生物胁迫,植物中ROS的合成和平衡状态受一系列酶的调节,例如超氧化酶歧化酶(SOD),过氧化氢酶(CAT)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)。miRNA是一类非编码RNA,通过调控靶向基因的表达在植物发育和防御反应中发挥重要作用。以前的研究发现miR398b在水稻抗病中发挥功能。但其潜在机制尚不清楚。在这项研究中,表征了miR398b目标基因的突变体
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