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Plos Genetics|TaTLP1与TaPR1相互作用以促进小麦对叶锈菌的防御反应

Plos Genetics|TaTLP1TaPR1相互作用以促进小麦对叶锈菌的防御反应

河北农业大学的研究人员于Plos Genetics上发表了一篇题为“TaTLP1 interacts with TaPR1 to contribute to wheat defense responses to leaf rust fungus”的研究文献,该文献揭示了TaTLP1TaPR1相互作用以促进小麦对叶锈菌的防御反应。

文章来源

背景

Thaumatin样蛋白(TLP)是一类与致病相关的蛋白家族5(PR5)成员,是参与植物防御反应的常见植物蛋白,对植物病原体具有抗真菌活性。TaTLP1基因是从小麦中分离出来的,参与了小麦对叶锈病的防御反应。 本研究旨在鉴定TaTLP1的相互作用蛋白,并探讨小麦锈菌作用的机制。 设计了烟草中TaTLP1分子靶标的Pull-down实验,鉴定了与烟草致病相关的TaPR1蛋白,并通过酵母双杂交实验(Y2H)双分子荧光互补实验(BiFC)免疫共沉淀实验(Co-IP)证实了TaTLP1TaPR1的相互作用。


结果

通过GFP-Trap和质谱(MS)鉴定TaTLP1的相互作用蛋白

为了鉴定TaTLP1靶向的相互作用蛋白,使用GFP-Trap试剂盒进行Pull-down测定,TaTLP1-pEarlyGate103的样品与对照之间观察到了几个不同的条带。结果表明,TaTLP1TaPR1可能相互作用,并且与小麦叶锈菌抗性有关。

TaTLP1-pEarlyGate103及其相关蛋白的GFP-Trap免疫沉淀

1. TaTLP1-pEarlyGate103及其相关蛋白的GFP-Trap免疫沉淀


TaTLP1TaPR1由叶锈病诱导并具有相同的表达谱

为了进一步研究鉴定出的蛋白质是否在功能上与TaTLP1相互作用并调节TaTLP1,选择TaPR1进行下一步实验,结果发现,叶锈菌接种后TcLr19植物中TaTLP1TaPR1的表达水平相似,表明TaTLP1TaPR1的表达同样受到叶锈病的诱导。

TaTLP1和TaPR1在不亲和与亲和互作叶片中的表达谱

2. TaTLP1TaPR1在不亲和与亲和互作叶片中的表达谱


TaTLP1TaPR1体外相互作用

为了进一步评估TaPR1是否可以直接与TaTLP1相互作用,进行了体外酵母双杂交(Y2H)分析。结果支持了TaTLP1TaPR1可能相互作用的假设。

 TaPR1和TaTLP1之间相互作用的酵母双杂交分析

3. TaPR1TaTLP1之间相互作用的酵母双杂交分析


通过BiFC,荧光共定位和Co-IP分析证实了TaTLP1TaPR1之间的相互作用

为了验证TaTLP1TaPR1之间的相互作用,生成了BiFC构建体,将ΔspTaTLP1-pENTRΔspTaPR1-pENTR重组为二元载体pDEST-VYNE-GWpDEST-VYCE-GW。在烟草中瞬时共表达ΔspTaTLP1-VYNE-GWΔspTaPR1-VYCE-GW进行BiFC分析。与阳性对照相似,在共表达ΔspTaTLP1-VYNE-GWΔspTaPR1-VYCE-GW的细胞中观察到了强烈的荧光信号,但是在阴性对照中没有观察到。

 TaTLP1与TaPR1相关联

4. TaTLP1TaPR1相关联


然后使用荧光共定位技术在体内进一步研究了这种相互作用。当TaTLP1-pGWB454TaPR1-pEarlyGate103共表达时,检测到重叠的荧光。这些结果表明TaTLP1在植物细胞质外体中与TaPR1相互作用。瞬时表达后进行免疫共沉淀测定,以进一步验证TaTLP1TaPR1 在体内的相互作用。综上,这些观察结果支持TaPR1TaTLP1 在体内相互作用。



TaPR1稳定TaTLP1的积累

使用蛋白酶体抑制剂MG132来检查和比较TaTLP1的稳定性和积累,以测试它是否受该途径调节。结果表明TaPR1通过抑制26S蛋白酶体介导的降解来稳定TaTLP1

 TaPR1稳定了TaTLP1的积累并增强了对小麦叶锈病的抗性

5. TaPR1稳定了TaTLP1的积累并增强了对小麦叶锈病的抗性



TaPR152个氨基酸的保守区域参与其与TaTLP1的结合

为了定义与TaTLP1相互作用所需的TaPR1区域,使用SWISS-MODEL初步预测了蛋白质的互作强度,并生成了两个N末端和三个C末端截短的TaPR1蛋白质变体。结果表明相互作用需要TaTa1C端区域有52个氨基酸,但TaPR1的其余区域对于与TaTLP1相互作用也是必需的。

 蛋白质二级结构的预测

6.蛋白质二级结构的预测

 TaPR1和其他同源蛋白质的蛋白质序列比对

7.TaPR1和其他同源蛋白质的蛋白质序列比对


为了进一步定义二硫键在稳定TaPR1-TaTLP1相互作用,确定赋予TaTLP1相互作用的单个蛋白质结构中的作用,构建了两个突变的TaTLP1蛋白,进行下一步研究,结果表明TaTLP1C端半胱氨酸突变影响了它与TaPR1的相互作用但其并不是TaPR1TaTLP1相互作用所必需的。

 与TaTLP1相互作用需要TaPR1的52个氨基酸保守域

8.TaTLP1相互作用需要TaPR152个氨基酸保守域

 

与单独的TaTLP1TaPR1相比,TaTLP1-TaPR1的抗真菌活性更高

为了初步确定TaTLP1-TaPR1在小麦叶锈病的抗性中的作用,进行了生长抑制试验。结果表明,与单独的TaTLP1TaPR1相比,TaTLP1-TaPR1的抗真菌活性更高,组合使用的蛋白质通过抑制叶片的生长有助于抵抗小麦叶锈病。

 TaTLP1-TaPR1 的体外抗真菌活性

9.TaTLP1-TaPR1 的体外抗真菌活性


TaTLP1TaPR1的共沉默显著增强了小麦的敏感性

为了进一步证实TaTLP1TaPR1之间的相互作用在小麦对叶锈病的抗性中的作用,采用BSMV病毒诱导的基因沉默(VIGS)系统分别敲低TaTLP1TaPR1的转录,并分析其对小麦对病原体感染的反应。使用qPCR 检测了被感染叶片中TaTLP1TaPR1的相对表达水平。结果表明,TaTLP1的相对表达分别显著降低,敏感性表型增强是TaTLP1TaPR1沉默所致。

 TaTLP1和TaPR1的共沉默显著增强了小麦的敏感性

10. TaTLP1TaPR1的共沉默显著增强了小麦的敏感性


在感染了叶锈病的易感对照和沉默的植物中均观察到组学变化,表明TaTLP1/TaPR1的共沉默降低了小麦对叶锈病的抗性。

 在感染了叶锈病的易感对照和沉默的植物中均观察到组学变化

11. 在感染了叶锈病的易感对照和沉默的植物中均观察到组学变化


ROS浓度高会诱导植物细胞死亡,对H2O2的积累进行了评估,以进一步了解TaTLP1/TaPR1如何参与小麦抗性。为了进一步确认沉默植物中ROS积累的减少,并了解降低的氧化胁迫耐受性的机制,测定了参与ROS信号,过氧化氢酶(TaCAT和超氧化物歧化酶(TaSOD)的基因的表达。观察到TaTLP1TaPR1,尤其是TaTLP1/TaPR1-敲低植物中TaCATTaSOD转录物的积累增加。表明TaTLP1TaPR1可能对其各自的功能具有协同作用。

 在24、48和120 hpi时,在这些叶片中观察到H2O2的产生和坏死

12.2448120 hpi时,在这些叶片中观察到H2O2的产生和坏死


结论

综上所述,我们的发现表明TaTLP1-TaPR1复合物在小麦抗叶锈病中具有积极作用,并调节ROS的生成,加强了我们对PR蛋白的认识,提供有关植物免疫分子机制的见解。将来,我们计划评估结合这两种PR蛋白的转基因植物的抗性。

参考文献

1Hamamouch N, Li C, Seo PJ, Park CM, Davis EL. Expression of Arabidopsis pathogenesis-related genes during nematode infection. Molecular Plant Pathology. 2011; 12:355–364.

2Van Loon LC, Rep M, Pieterse CM. Significance of inducible defense-related proteins in infected plants. Annual Review of Phytopathology. 2006; 44:135–162.

3Ferreira RB, Monteiro S, Freitas R, Santos CN, Chen Z, Batista LM, et al. The role of plant defence proteins in fungal pathogenesis. Molecular Plant Pathology. 2007; 8:677–700.

文献链接

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1008713

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Thaumatin样蛋白(TLP)是一类与致病相关的蛋白家族5(PR5)成员,是参与植物防御反应的常见植物蛋白,对植物病原体具有抗真菌活性。TaTLP1基因是从小麦中分离出来的,参与了小麦对叶锈病的防御反应。 本研究旨在鉴定TaTLP1的相互作用蛋白,并探讨小麦锈菌作用的机制。 设计了烟草中TaTLP1分子靶标的Pull-down实验,鉴定了与烟草致病相关的TaPR1蛋白,并通过酵母双杂交实验(Y
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